含人類骨保護素基因的重組慢病毒載體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種制備重組慢病毒載體的方法。更具體 地，涉及含有人類骨保護素基因的重組慢病毒及其制備方法以及該重組慢病毒載體在制備 治療牙周骨缺損材料中的用途。
【背景技術】
[0002] 牙周病是發生在牙齒支持組織的炎癥性、破壞性疾病，以牙槽骨的吸收破壞為主 要特征。在臨床治療中通過牙周病的基礎治療、牙周手術（根面處理技術、引導性牙周組織 再生術、骨移植）和藥物治療，對消除致病因素、促使炎癥減輕有一定療效，但難以恢復正 常的牙槽嵴高度、形成新附著。
[0003] 組織工程技術為牙周組織再生提供了新方法。生長因子是組織工程的重要因素， 它們能調控包括牙周來源在內的多種細胞的增殖、遷移、分化和外基質的合成，在牙周組織 再生的修復中發揮重要作用。但是傳統的組織工程方法應用生長因子時，多將生長因子局 部注射或復合細胞和支架材料后植入體內，由于生長因子多為蛋白質或多肽，在體內極易 降解，生物半衰期短，容易被體液沖走或稀釋，因此難以保持局部有效治療濃度。
[0004] 基因治療為生長因子持續、穩定表達提供了新方法。借助基因治療的手段（如轉 基因技術），將生長因子的基因轉移到牙周組織相關靶細胞內，當基因導入靶細胞后，這些 細胞便可以充當微型"生物工廠"，持續釋放細胞因子，促使靶細胞的表型向再生方向分化； 并通過自分泌或旁分泌作用對細胞自身以及周圍未轉染的細胞產生作用，促使整個缺損區 的所有細胞活化，從而提高牙周組織再生的成功率。
[0005]目前利用組織工程和基因治療技術以及兩者相結合促進牙周組織修復再生已成 為牙周領域的研究熱點。有部分學者利用該技術在牙周病治療、促進牙槽骨新生方面進行 了研究，通過牙周膜細胞（Periodontalligamentcell^roLCj體外培養，并將骨形成蛋 白（Bonemorphogeneticprotein，BMPs)或血小板生長因子（Platelet-derivedgrowth factor，TOGF)等促進骨形成基因轉染至牙周膜細胞，回植到牙周組織缺損處，發現有促進 牙槽骨形成的作用。然而，牙周組織是由牙骨質、牙周膜、牙槽骨與牙齦共同構成的三維結 構，牙周病是細菌等各種病原因素對這四者的共同破壞，雖然通過牙周手術，包括使用牙周 組織工程方法在提供修復用細胞、促進組織形成等方面有一定作用，但是，在病變牙周組織 中主要是各種刺激因素導致的大量破骨細胞活化，抑制了牙周組織的成骨能力，使組織修 復無法達到理想效果。因此，單一依靠促進骨形成來治療牙周病效果未盡人意。
[0006]骨保護素（osteoprotegerin，0PG)是近年來發現的一種能阻止破骨細胞分化、 成熟，抑制骨吸收的關鍵因子。骨保護素是核因子kB受體活化因子配體（receptor activatorofnuclearfactorkBligand，RANKL)的天然誘傅受體，能競爭性地與核因 子kB受體活化因子配體結合，阻斷核因子kB受體活化因子（Receptoractivatorof nuclearfactor-kB，RANK)與核因子kB受體活化因子配體間的相互作用，從而抑制破骨 細胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究發現，核因子KB受體活化因子配體水平升高可以導 致牙周組織的破壞；檢測牙周病患者齦溝液顯示，RANKL/OPG比率比健康人群明顯升高；細 菌產生的毒素或是組織表達的炎癥介質也是通過影響RANKL/OPG比率而影響組織修復的。 這些研究結果表明，OPG/RANKL/RANK系統在牙周骨代謝中是重要的分子調節機制之一。
[0007] 牙周組織中最重要的一種細胞是roixs，有學者研究發現roixs可以表達骨保護素 和核因子kB受體活化因子配體，在沒有受到外界刺激時骨保護素表達較核因子kB受體 活化因子配體強，不利于破骨生成，以維持牙周內環境的穩定。揭示了H)LCS是通過0PG/ RANKL系統來調節牙槽骨代謝的。由于H)LCS位于牙槽骨和牙骨質之間，其分泌的骨保護素 可能在抵御炎癥組織中核因子kB受體活化因子配體介導的骨吸收中發揮一定的防御功 能。
[0008] 近年來，國內外學者利用骨保護素防治因破骨細胞過度活化而引起的骨吸收疾病 做了大量研究，發現骨保護素可有效抑制骨質疏松性骨吸收、惡性腫瘤骨轉移破壞等骨質 吸收疾病。但使用骨保護素治療牙周骨缺損還未見報道。
【發明內容】
[0009] 本發明是基于發明人的下列發現而完成的：
[0010] 發明人將組織工程化骨植入兔牙周骨缺損處，以磷酸三鈣作為生長空間，植 入的牙周膜干細胞在局部分化成成骨細胞、成牙骨質細胞和成纖維細胞，直接參與牙周骨 組織的再生；同時植入的牙周膜干細胞在體內存活、發生遷移、吞噬及分泌細胞外基質，并 吸引體內細胞至缺損區域，從而促進了牙周骨組織再生；另外植入的牙周膜干細胞不斷分 泌骨保護素蛋白，通過抑制核因子KB受體活化因子配體與破骨細胞表面的核因子KB受 體活化因子結合，抑制破骨細胞活化，抑制牙槽骨吸收，從而提高牙周骨愈合過程。
[0011] 本發明旨在解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提供了一種含有 人類骨保護素基因（hOPG)的重組慢病毒載體。
[0012] 根據本發明的一個方面，本發明提供了 一種含有人類骨保護素基因重組慢病毒載 體的制備方法。根據本發明實施例，該方法包括：
[0013] (1)合成人類骨保護素基因的編碼序列區域；
[0014] (2)將人類骨保護素基因的編碼序列區域克隆連接到T載體上；
[0015] (3)使用第一引物從連接骨保護素的T載體擴增兩端含有酶切位點的人類骨保護 素基因的編碼序列片段；
[0016] (4)將步驟（3)得到的基因片段連接到pIRES-EGFP載體上，獲得0PG-IRES-EGFP 載體；
[0017] (5)將步驟⑷制備的0PG-IRES-EGFP重組載體轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆；
[0018] (6)使用第二引物從陽性克隆擴增出0PG-IRES-EGFP序列，亞克隆到載體 pcDNA6. 2w上；
[0019] (7)將步驟（6)制備的重組載體上的所述0PG-IRES-EGFP序列經BP重組到入門載 體上，再經LR重組到pLenti6. 3/V5載體上，得到pLenti6. 3-hOPG-IRES-EGFP重組載體。
[0020] 發明人驚奇的發現，本發明制備載體的方法簡單，易于操作，并且利用該方法可以 獲得重組慢病毒載體，該案重組慢病毒載體能夠實現轉染基因在體內持續、穩定的表達；并 能用于極難轉染的干細胞和原代細胞。
[0021] 重組慢病毒載體根據本發明實施例，本發明制備方法中選用的酶切位點是Bgll 和BamHI。
[0022] 根據本發明實施例，本發明實施例前述的第一引物序列為：SEQN0 1(命名為 SF-F1)、SEQN0 2(命名為SF-R1)，第一引物的具體序列如下：
[0023]SF-F1 :5, -AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3'（SEQNO1);
[0024]SF-R1 :5, -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3,（SEQNO2);
[0025] 由此，擴增的精確率好、效率高。
[0026] 根據本發明實施例，本發明實施例前述的第二引物序列為：SEQN0 3(命
[0027]名為SF-F)、SEQN0 4(命名為SF-R2)，第二引物的具體序列如下：
[0028]SF-F:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC G-3'（SEQN0 3);
[0029]SF-R2:5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCG-3'（S EQN0 4)。
[0030] 由此，擴增特異性好、效率高。
[0031] 根據本發明的另一方面，本發明提供了一種含骨保護素基因的重組慢病毒載體。 根據本發明實施例，該載體是根據本發明實施例前述的方法制備的。
[0032] 發明人驚奇的發現，本發明的重組慢病毒載體能夠實現轉染基因在體內持續、穩 定的表達；并能用于極難轉染的干細胞和原代細胞，轉導效率高。
[0033] 根據本發明又一方面，本發明還提供了pLenti6. 3-h0PG-IRES-EGFP重組載體在 制備含有人類0PG基因的重組慢病毒中的用途。
[0034] 發明人驚奇地發現，利用本發明的重組載體制備的重組慢病毒，能夠實現轉染基 因在體內持續、穩定的表達；并能用于極難轉染的干細胞和原代細胞；同時，以該慢病毒為 載體的基因轉染不影響種子細胞與支架材料的黏附及其正常的生長。
[0035] 根據本發明實施例，所述重組慢病毒是將本發明前述構建的重組載體與慢病毒包 裝蛋白表達載體共轉染包裝細胞，并將包裝細胞裂解獲得所述重組慢病毒。由此，轉染效率 商。
[0036] 根據本