鮑曼不動桿菌膜蛋白a1s_0851作為抗原的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鮑曼不動桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗 原的應用。
【背景技術】
[0002] 鮑曼不動桿菌（Acinetobacterbaumannii)屬于奈瑟氏菌科，不動桿菌屬，是一種 不發酵糖類、氧化酶陰性、不能運動的革蘭氏陰性桿菌。鮑曼不動桿菌廣泛存在于自然界的 水及土壤、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。鮑曼不動 桿菌對溫、熱、紫外線及化學消毒劑均有較強的抵抗力，常規的消毒劑只能抑制其生長，不 能將其殺滅，因此，鮑曼不動桿菌常藏匿于各種醫療器械及醫院病房角落，對于重癥患者， 如老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長期使用廣譜 抗生素治療的患者來說，鮑曼不動桿菌可成為重要的致病菌。臨床上，其主要引起肺部感 染，也可引發敗血癥、嚴重軟組織或傷口感染、插管相關感染、尿路感染、菌血癥和繼發性腦 膜炎等癥狀。醫院感染的科室分布以重癥監護室為最多，其次為呼吸內科。
[0003] 鮑曼不動桿菌感染有著悠久的歷史，從20世紀八十年代起就有了鮑曼不動桿菌 感染爆發的報道，而自美國1991年報道了耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（CRAB)菌株后，各國均 陸續報道了耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌，且據統計數據，其比例逐年升高。鮑曼不動桿菌的感 染與耐藥已經成為一個世界性難題，常呈多重耐藥和泛耐藥，且耐藥菌在特定人群中常引 起大規模爆發流行，感染患者的病死率常高達75%。2010年中國耐藥檢測的監測數據顯示 不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為30. 7%，對米諾環素耐藥率為31. 2%，其他藥物如 亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西/舒巴 坦、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星等耐藥率均在50%以上。由于耐藥性及耐藥機制復雜，鮑 曼不動桿菌的耐藥菌株引發的感染已經成為臨床上非常棘手的問題。普通抗生素對它的治 療作用已不明顯，鮑曼不動桿菌即將面臨無抗生素可治的境地，采用疫苗來預防和控制鮑 曼不動桿菌的感染，特別是對抗高度耐藥鮑曼不動桿菌的感染已成為刻不容緩的任務。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種鮑曼不動桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗原 的應用。
[0005] 本發明所述技術方案如下：
[0006] 1、鮑曼不動桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗原的應用，所述膜蛋白A1S_0851的氨基 酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] 2、鮑曼不動桿菌重組蛋白A1S_0851在制備疫苗中的應用，所述重組蛋白 A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 3、由鮑曼不動桿菌重組蛋白A1S_0851制備得到的鮑曼不動桿菌疫苗，所述重組 蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 優選的，所述疫苗還包括佐劑，所述佐劑為終濃度13. 5mg/mL的氫氧化鋁。
[0010] 優選的，所述疫苗還包括稀釋液，所述稀釋液pH值為6. 0,由濃度為10mM的組氨 酸、質量分數〇. 9%的NaCl和質量分數0. 01 %的泊洛沙姆188組成。
[0011] 4、上述疫苗的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)用pH值為6. 0的疫苗稀釋液溶解濃度為30mg/mL的氫氧化鋁佐齊IJ，得溶液A; 所述氫氧化鋁佐劑與疫苗稀釋液的體積比為9:1;
[0013] (2)用步驟（1)所述疫苗稀釋液稀釋重組蛋白A1S_0851，得蛋白濃度為0.3yg/ yL的溶液B;
[0014] (3)取等體積的溶液A和溶液B于4~32°C條件下進行吸附，即得疫苗。
[0015] 5、上述疫苗在制備預防或治療鮑曼不動桿菌感染的藥物中的應用。
[0016] 6、鮑曼不動桿菌重組蛋白A1S_0851作為抗原免疫動物得到的抗體，所述重組蛋 白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0017] 優選的，所述抗體為免疫小鼠或者兔得到的IgG抗體。
[0018] 本發明的有益效果在于：本發明通過分析鮑曼不動桿菌基因信息，選取鮑曼不動 桿菌的膜蛋白A1S_0851作為疫苗的候選抗原，通過基因工程的手段，選用pEGX-6P-2融合 蛋白表達載體對A1S_0851抗原進行克隆、表達，并用表達的重組蛋白免疫小鼠進行抗原性 評價以及抗鮑曼不動桿菌感染的免疫保護性評價，結果表明鮑曼不動桿菌A1S_0851基因 編碼的蛋白具有抗鮑曼不動桿菌感染的效果，是理想的鮑曼不動桿菌疫苗抗原。與全菌滅 活疫苗相比，由于全菌滅活疫苗外膜復合物成分比較復雜，可能含有效的保護性抗原成分， 也可能存在與免疫保護無關或者副作用的成分，且制備過程難于標準化，而基因工程亞單 位疫苗抗原成分明確，效果明確，副作用小，安全性高，是一種理想的疫苗形式。
【附圖說明】
[0019] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0020] 圖1鮑曼不動桿菌A1S_0851基因PCR擴增凝膠電泳結果；其中，M泳道為marker， 1泳道為A1S_0851基因PCR擴增產物。
[0021] 圖2pGEX-6p-2/AlS_0851重組質粒凝膠電泳鑒定結果；其中，1~4泳道為重組質 粒，M泳道為marker，其中泳道3為鑒定正確的重組質粒。
[0022] 圖3重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue誘導表達重組蛋白A1S_0851結 果；其中，M泳道為marker，1~3泳道依次為16、25和30°C條件下IPTG誘導處理后，破碎 菌體并離心所得上清液中的重組蛋白A1S_0851 ;4~6則依次為16、25和30°C條件下IPTG 誘導處理后，破碎菌體并離心所得沉淀中的重組蛋白A1S_0851。
[0023] 圖4重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue發酵過程中細菌的生長曲線圖； 整個生長曲線比較標準，前期細菌生長較快，后期誘導時曲線較平穩。
[0024] 圖5重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue發酵獲得的目的蛋白鑒定結果； 各泳道從左到右依次為maker、IPTG誘導lh、2h、3h、4h;由圖可知，經過工程菌發酵成功獲 得重組A1S_0851蛋白。
[0025] 圖6對發酵獲得的重組蛋白A1S_0851經GST瓊脂糖凝膠4B親和層析的純化結果 圖，結果顯示，目的蛋白純度在95%以上，目的蛋白分子量在33kDa左右，與預期大小相符 合。M:蛋白標準品，泳道1 :重組蛋白A1S_0851與GST融合蛋白，泳道2為純化后經酶切后 的重組蛋白A1S_0851。
[0026] 圖7重組蛋白A1S_0851Q HP層析圖。
[0027] 圖8為重組蛋白A1S_0851經QHP層析后SDS-PAGE結果圖，圖中，泳道1:標準蛋 白；泳道2 :GST親和PP酶切后洗脫樣品；泳道3:QHP流穿樣品；泳道4:QHP層析后樣品。
[0028] 圖9為重組蛋白A1S_0851QHP層析去內毒素后SDS-PAGE結果圖，圖中，泳道1: 標準蛋白；泳道2:QHP層析去內毒素后樣品。
[0029] 圖10鮑曼不動桿菌攻毒后，不同濃度菌液的小鼠生存率圖。
[0030] 圖11重組蛋白A1S_0851免疫后第14天，ELISA檢測小鼠免疫后疫苗抗原特異性 IgG體液應答水平，實驗組滴度與氫氧化鋁佐劑對照組及疫苗稀釋液對照組滴度相比，均有 顯著差異（P〈〇.〇l)。
【具體實施方式】
[0031] 下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0032] 鮑曼不動桿菌ATCC國際標準株ATCC17978,由美國ATCC提供；引物由TaKaRa 公司合成；宿主菌株XLl-blue大腸桿菌購于美國安捷倫公司；質粒pGEX-6p-2購于美國 GEHealthcare公司；primeSTARHSDNA聚合酶、DNA分子量標準（marker)、限制性內切 酶BamHI和NotI、蛋白分子量標準（marker)、DNA連接酶均購于大連TakaRa公司；細菌 基因組提取試劑盒購于天根公司；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購于美國Omega公 司；氨芐西林、卡那霉素購自華北制藥股份有限公司；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購自美國GE Healthcare公司；高壓勾質機APV-1000購自丹麥AnInvernsysGroup;BALB/C小鼠購自 北京華阜康公司；氫氧化鋁佐劑購自美國GENERALCHEMICAL公司；藥用級組氨酸購自美國 Merck公司；藥用級泊洛沙姆188購自美國Merck公司，無熱原。
[0033] 試劑配制：
[0034] 5X蛋白質上樣緩沖液由以下組分組成：PH6.8,250mMTris-HCl10% (W/V)，SDS 0? 5% (W/V)，溴酚藍50% (