青蒿AaGTD1基因及其編碼的蛋白與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種青蒿中控制青蒿素合成和腺毛發育的AaGTDI基因及其編碼的蛋白與在制備青蒿素中的應用。
【背景技術】
[0002] 瘧疾是一種全球性疾病，它威脅著全世界約一半人口的健康。2010年約有2. 19億 瘧疾病例，有66萬人死亡。據WHO2013年報道，99個國家和地區有持續性的瘧疾傳播。來 自無瘧疾地區的無免疫力旅客在感染后病情會特別嚴重。對于瘧疾特別是惡性瘧現有的最 佳治療方法，是以青蒿素為基礎的聯合療法。青蒿素是一種合成于我國藥用植物青蒿腺毛 的倍半萜內酯過氧化物，而且青蒿是青蒿素的唯一天然來源。對于這種每年銷售額超過億 次治療的藥物，青蒿素聯合療法的供應仍然依賴于農業生產的青蒿素。因此，如何最大限度 的提高青蒿素產量，越來越成為人們研宄的重中之重。優良青蒿品種的培育，不僅能降低青 蒿素的成本、穩定供應，而且能提高農民農作物的種植信心。
[0003] 青蒿是主產于我國的一種常見的菊科蒿屬的一年生草本植物，20世紀70年代其 提取物青蒿素被發現在抗瘧方面與傳統的奎寧類抗瘧藥物具有不同的作用機理且療效顯 著。目前以青蒿素為基礎的藥劑已成為全球治療皰疾的首選藥物。青蒿素及其衍生物不僅 對瘧疾等寄生蟲疾病有著重要的作用，同時還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的 功能，對乳腺癌、紅斑狼瘡、風濕等有顯著療效。開發青蒿素及其衍生物的其它用途將進一 步增大青高素的需求。
[0004] 腺毛是青蒿素體內合成、分泌、積累及儲存的場所。青蒿的葉和莖上面布滿了這種 腺毛，目前所知道的參與青蒿素合成代謝途徑的基因都在腺毛中表達。青蒿素和一些其他 生物活性物質對植物本身有很高的毒性，所以將其扣押在或者分泌出合成部位就顯得非常 重要，腺毛的表皮下空間很可能就是青蒿扣押青蒿素和其它植物毒性物質的場所。
[0005] 腺毛是毛狀體的一種，毛狀體是許多植物葉片和其它器官表面的小突起結構，它 們可以分為兩大類：有腺體的和無腺體的。青蒿的腺毛由10個細胞組成，包括兩個基底細 胞，兩個莖細胞，6個分泌細胞，還有頂部的表皮下空間。其中青蒿素主要在位于外側的兩個 分泌細胞合成，然后分泌到并儲存于腺毛最外面的表皮下空間，而內側的兩對分泌細胞含 有葉綠素，具有其它功能。毛狀體的最大特征就是他們能夠合成，儲存，有時候還能分泌大 量特定的代謝產物，包含多種類型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和類黃酮。許多毛 狀體產生的化合物具有重要的醫藥，香料，食品添加劑，天然殺蟲劑等商業價值。近年來將 腺毛開發成"化學工廠"來生產高價值的植物產物引起了植物生物技術專家的關注。
[0006] 同時，由于植物表達體系的方便、廉價等有點，利用轉基因植物生產藥用蛋白越來 越受重視，并迅猛發展，已有100余種蛋白得到表達，有些已進入商業化生產。因此，從青蒿 中分離出參與青蒿腺毛發育和青蒿素合成的基因有重大意義，在藥物研發及農業生產上有 重要作用。
[0007] 中國專利申請CN201410374611. 2,發明名稱為"青蒿AaMYBLl蛋白編碼序列及 其應用"，申請公布號為CN104152463A，公開了一種青蒿MYB-like類轉錄因子編碼序列AaMYBLl，利用轉基因技術將青蒿AaMYBLl轉錄因子干擾載體轉化青蒿可以有效調控青蒿 表皮的腺毛密度，從而提高青蒿素的含量。
[0008] 中國專利申請CN201410278312. 9,發明名稱為"一種轉iaaM基因提高黃花蒿中青 蒿素含量的方法"，申請公布號為CN104059940A，公開了一種構建iaaM基因在黃花蒿腺毛 細胞特異表達的載體，利用根癌農桿菌介導法轉化黃花蒿，以提高黃花蒿中青蒿素含量的 方法。
[0009] 中國專利CN201110344258.X，發明名稱為"青蒿bHLH轉錄因子及其編碼基因與應 用"，申請公布號為CN102372769A，公開了一種青蒿bHLH轉錄因子，將bHLH轉錄因子瞬時轉 化到青蒿植株內過表達，其所調控的青蒿素生物合成代謝中的關鍵酶表達量大幅度提高， 可以用來生產青蒿素。
[0010] 經對現有技術的文獻檢索發現，尚未有關青蒿AaGTDl基因及其編碼的蛋白的報 道。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種青蒿中控制青蒿素合成和腺 毛發育的AaGTDl基因及其編碼的蛋白，本發明的另一目的在于提供AaGTDl基因及其編碼 的蛋白在制備青蒿素中的應用。
[0012] 本發明是通過以下的技術方案實現的，
[0013] 本發明的第一方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1 所示。
[0014] 所述的青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列為543bp。
[0015] 本發明的第二方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如 SEQIDN0:2 所示。
[0016] 所述的青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為180aa。
[0017] 本發明的第三方面，提供了一種青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組 菌或轉基因植物。
[0018] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組菌或轉基因植物中，用于 擴增青蒿AaGTDl基因全長的引物對，所述的引物對中，一條引物序列如SEQIDN0:3所示， 另一條引物序列如SEQIDN0:4所示。
[0019] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組菌或轉基因植物中，所述 的重組表達載體為質粒PHB_35SX2-AaGTDl。
[0020] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組菌或轉基因植物中，所述 的重組菌，即宿主細胞，為大腸桿菌、農桿菌等。
[0021] 所述的青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組菌或轉基因植物中，所述 的轉基因植物為轉基因黃花蒿。
[0022] 本發明的第四方面，提供了青蒿AaGTDl基因、青蒿AaGTD1基因編碼的蛋白，以及 青蒿AaGTDl基因的表達盒、重組表達載體、重組菌或轉基因植物，在制備青蒿素中的應用。
[0023] 進一步地，本發明提供了青蒿AaGTDl基因編碼的蛋白在作為轉錄因子的應用。
[0024] 本發明的AaGTDl基因編碼的蛋白是一個AP2/ERF類的轉錄因子，AaGTDl基因表 達在青蒿幼嫩葉片和花苞中，參與了青蒿腺毛的發育和青蒿素的合成，因此可以用來生產 新的高青蒿素含量的青蒿品系，在農業生產上具有十分重要的應用。
[0025] 所述的應用，具體是：通過轉基因方法提高植物組織中青蒿AaGTDl基因的表達 量；
[0026] 所述的應用，具體是：青蒿AaGTDl基因在提高植物組織中與促進青蒿素合成相關 的酶的編碼基因的表達量中的應用，所述的促進青蒿素合成相關的酶的編碼基因是ADS、 CYP71AV1，或DBR2
[0027] 所述的植物為黃花蒿。
[0028] 本發明的第五方面，提供了一種提高黃花蒿中青蒿素含量的方法，包含以下步 驟：
[0029]A、構建青蒿AaGTDl基因的重組表達載體；優選的，是將如SEQIDNO: 1所示的 AaGTDl基因連于植物表達調控序列上，構建含重組的植物表達載體；
[0030] B、將步驟A的重組表達載體轉入宿主細胞農桿菌，優選的宿主細胞為農桿菌 H1105;并將其轉化青蒿的愈傷組織；
[0031] C、通過抗生素篩選得到轉化成功的青蒿細胞，并培育使之長成完整植株；所得的 轉基因植株中青蒿素含量得到提高。
[0032] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明的AaGTDl基因編碼的蛋白 可以用來生產新的高青蒿素含量的青蒿品系，在青蒿素的獲得和農業生產上具有十分重要 的應用；此外，該基因編碼一個AP2/ERF類的轉錄因子，能夠與青蒿素合成路徑中的關鍵酶 基因ADS，CYP71AV1的啟動子相結合，并調控ADS，CYP71AV1基因的表達，從而調控青蒿素的 合成。細胞生物學分析表明抑制AaGTDl基因的表達可以使青蒿的分泌型和非分泌型腺毛 都發育異常，因此AaGTDl基因也參與了青蒿腺毛的發育，并起到了非常重要的作用。
【附圖說明】
[0033] 圖lAaGTDl基因的結構域示意圖。
[0034] 圖2RT-PCR顯示AaGTDl基因的時空表達模式，其中A為AaGTDl基因在根、莖、老 葉、嫩葉、幼嫩花苞、成熟花苞及花中的表達情況。B為AaGTDl基因在