南方根結線蟲mif基因在降低線蟲對植株致病性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及南方根結線蟲MIF基因在降低線蟲對 植株致病性中的應用。
【背景技術】
[0002] 根結線蟲是專性內寄生植物病原線蟲，可寄生超過3000種植物，對農業生產造成 嚴重危害，每年產生巨大經濟損失，被稱為世界上最具破壞性的植物病原物。在我國以南方 根結線蟲（M.incognita)分布最廣，近幾年來，我國農業種植結構不斷調整，設施蔬菜栽培 面積迅速發展，為南方根結線蟲的發生、發展提供了適宜的環境，土壤中的南方根結線蟲量 快速增加，嚴重威脅我國農業生產安全。輪作、生物熏蒸、生物防治及化學農藥是防治線蟲 的主要方法，但是存在防治效果差、污染環境等問題。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migrationinhibitoryfactor，MIF)，是1966年發現的第一個可溶性淋巴因子，它可吸引 巨噬細胞在遲發型變態反應中浸潤、聚集，還可促進巨噬細胞增生以及刺激巨噬細胞分泌 多種細胞因子。MIF作為一種潛在的促炎癥細胞因子，是天然免疫和獲得性免疫中的關鍵 調節元件，通過多種途徑促進免疫應答和炎性反應。哺乳動物（如人、小鼠、大鼠、牛等）的 MIF蛋白氨基酸序列有90%的同源性，而且在雞、魚、蜱、寄生蟲、藍細菌等物種間有同源性 和保守性。
[0003] RNA干擾（RNAi)是研宄植物線蟲的一種重要的反向遺傳學手段。通過人工合成靶 基因的dsRNA或siRNA，并溶解在線蟲浸泡緩沖液中，在章魚胺、間苯二酚等神經調節劑作 用下，寄生前二齡幼蟲攝取溶液中的dsRNA或siRNA，從而引發內源基因的RNA干擾，稱為體 外RNAi技術（invitroRNAi);通過構建線蟲靶基因的RNAi載體，并遺傳轉化寄主植物， 使線蟲在寄生取食時，從寄主植物細胞中吸取dsRNA或siRNA，從而引發內源基因的RNA干 擾，稱為體內RNAi技術（invivoRNAi)。RNAi不僅有助于分析植物線蟲的基因功能，而且 可以評價目標基因作為抗線蟲靶標的應用潛力。
[0004] 盡管已經克隆了南方根結線蟲大量與寄生致病相關的基因，但目前只有少數基因 的作用機制被詳細研宄。大量研宄表明，植物寄生線蟲分泌的效應蛋白在與寄主互作致病 過程中發揮重要作用。多數推測的寄生致病相關基因在線蟲食道腺、體壁、口器等部位表 達，編碼產生分泌蛋白，再經由口針穿刺、注射或直接由體壁分泌進入植物細胞內，發揮寄 生致病相關的復雜功能，大多數的研宄集中在食道腺分泌的效應蛋白，但由線蟲體壁分泌 并參與免疫調節的相關寄生致病效應蛋白的研宄結果不多。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供南方根結線蟲MIF基因在 降低線蟲對植株致病性中的應用。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0007]本發明提供了南方根結線蟲MIF基因在降低線蟲對植株致病性中的應用，所述 MIF基因為如SEQIDNo. 1所示的AMIF基因、如SEQIDNo. 2所示的BMIF基因或如SEQIDNo.3所示的CMIF基因。
[0008] 所述BMIF基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0009] 進一步地，所述應用為通過抑制線蟲MIF基因的表達，降低線蟲對植物植株的為 害。
[0010] 本發明還提供了南方根結線蟲MIF基因在培育抗南方根結線蟲轉基因植株中的 應用，所述MIF基因為如SEQIDNo.1所示的AMIF基因、如SEQIDNo.2所示的BMIF基因 或如SEQIDNo.3所示的CMIF基因。
[0011] 進一步地，所述應用為將BMIF基因編碼區的l-329bp或與其相似性大于90 %的核 苷酸序列作為RNAi干擾片段，構建RNAi干擾載體，通過農桿菌介導法獲得抗南方根結線蟲 的轉基因植物。所述構建的RNAi干擾載體，可沉默根結線蟲的AMIF、BMIF和CMIF基因。
[0012] 更進一步地，所述應用為將BMIF基因編碼區的l-329bp作為RNAi干擾片段，按 正反方向構建于PSAT5干擾載體Intron兩側，再將含有BMIF正反向干擾片段和Intron 區的大片段用Xbal/Kpnl雙酶切從pSAT5載體上切下，連接于psuper植物表達載體，構建 psuper-BMIF-Ri植物轉基因RNAi干擾載體，通過農桿菌介導法獲得抗南方根結線蟲的轉 基因植物，其防治根結線蟲的效果在70%左右。
[0013] 本發明還提供了南方根結線蟲BMIF基因，所述BMIF基因的核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
[0014] 本發明還提供了用于克隆所述BMIF基因的引物，所述引物包括：
[0015]上游引物BMIF-superF :5'-ATGCCAATTTTACAAGTT-3'；
[0016]下游引物BMIF-superR :5'-TTATCCTTTTAATTTCCCATC-3'。
[0017] 本發明還提供了克隆所述BMIF基因的方法，具體為：
[0018] 取接種南方根結線蟲45-60天的番茄根系，洗凈后挑取卵塊在無菌水中連續孵化 3天，離心收集每天孵化的新鮮的二齡幼蟲；將洗凈的根經過酶消解，分離、收集不同蟲態 的線蟲；液氮冷凍，組織研磨器破碎樣品，用磁珠法提取mRNA，反轉錄得到南方根結線蟲二 齡幼蟲cDNA，以該cDNA為模板，利用權利要求7所述引物進行PCR擴增。
[0019]進一步地，所述PCR擴增體系為：ddH20 28 y L，5XPhusion HF buffer 10 y L， 2.5mM dNTPs 4yL,BMIF-superF 2. 5yL,BMIF-superR2. 5yL, cDNA 1. 0yL,Phusion DNA polymerase (NEB) 0? 5 y L，DMS01. 5 y L,總體系50 y L〇
[0020] 進一步地，所述PCR擴增條件為：98°C預變性30s;98°C變性10s，58°C退火30s， 72. 0°C延伸lmin，共30個循環；72. 0°C保溫lOmin后終止反應。
[0021] 本發明的有益效果在于：
[0022] 本發明首次發現南方根結線蟲BMIF基因，有兩個拷貝串聯排列，并且在線蟲體壁 表達。并進一步通過實驗證實了其為線蟲體壁分泌并具有參與免疫調節功能的寄生致病相 關效應蛋白。沉默該基因防治根結線蟲的效果達70%左右，為培育抗南方根結線蟲轉基因 植株的研宄提供了靶標。為尋找防治根結線蟲的新靶標并制定防治新策略提供了理論依 據。
【附圖說明】
[0023] 圖1為三種不同MIF基因編碼區序列比對。
[0024] 圖2為BMIF基因在各蟲態的相對表達量分析。
[0025] 圖3為BMIF基因正反義探針引物PCR擴增；
[0026] 其中：1:未標記正義探針；2 :DIG標記正義探針；3:未標記反義探針；4 :DIG標記 反義探針。
[0027] 圖4為BMIF基因的線蟲組織原位雜交。
[0028] 圖5為構建BMIF體內RNAi干擾載體及雙酶切驗證Xbal和Kpnl。
[0029] 圖6為Re