一種種皮與纖維組織特異性表達啟動子sfs及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種種皮與纖維組織特異性表達啟動子SFS及其應用，具體為一種能 夠在植物種子表皮和棉花纖維特異表達的啟動子ProSFS (簡稱為SFS啟動子）以及該啟動 子在植物遺傳改良上的應用。
【背景技術】
[0002] 植物生長發育是不同基因在時間、空間上有序表達和協同作用的過程。基因在整 個生長過程中的開關、表達模式以及表達豐度等均受到精確調控。植物基因的表達調控可 以分為轉錄前、轉錄、轉錄后、翻譯、翻譯后等5個不同水平，其中轉錄水平上的調控是最主 要和最為關鍵的環節。基因在轉錄水平上的調控主要是通過調控轉錄調節因子與啟動子的 結合與否、強弱變化等來實現。因此，分離克隆有關特異的啟動子可以有效調芐基因的轉錄 水平，包括基因在不同組織以及不同環境條件下的表達。此外，獲得組織特異性啟動子對于 轉基因作物的研宄以及商業化開發都具有重大意義。
[0003]組織器官特異型啟動子按照植物組織器官可以分為根、維管束、花器官、種子特異 以及其它組織特異表達啟動子等。組織器官特異型啟動子可以定向表達外源蛋白，在發育 生物學研宄、以及植物基因工程方面逐步得到應用。果實和種子是植物的生殖器官、營養物 質主要的儲藏場所。利用果實或種子等器官特異啟動子來調控相應的目的基因表達，不但 可以提高基因在這些部位的表達量，而且可以降低生物能耗，有利于表達產物的分離以及 提高作物的產量和品質。
[0004] 來源于小麥的TaPR61基因啟動子在禾本科作物中可以維持其種子特異表達的模 式（Kovafchuk et al，2012)。瓜爾豆甘露糖聚合酶基因的啟動子能夠在紫花苜蓿的胚乳 組織中特異表達（Naoumkina and Dixon, 2011)。近年來，分離與種子特異表達有關的啟動 子還包括：來源于西瓜的果實特異表達基因AGPL1的啟動子（Yin et aL，2009)、番茄的E8 基因啟動子等。研宄表明：2個胚乳特異表達順式作用元件一GCN4和AACA對于維持基因 的胚乳特異表達模式起著重要的作用（Qu and Takaiwa, 2004 ;Wu et aL, 1998 ;Takaiwa et aL，1996)。此外，糊粉層特異表達的基因ALJ啟動子、胚乳特異表達啟動子Gtl3a在生物反 應器上展現了很好的應用前景（Kuwano et al，2011 ;He et al，2011)。
[0005]盡管科學家已經在不同的植物種克隆了上述與種子特異表達有關的啟動子，但是 到目前為止還沒有有關具有種皮特異和棉花纖維組織特異的啟動子報道。
【發明內容】
[0006]本發明針對上述技術缺陷，目的在于提供一種種皮與纖維組織特異性表達啟動 子-SFS及其應用，即提供一種新的能夠在植物種皮以及棉花纖維組織中特異表達的啟動 子SFS〇
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0008]第一方面，本發明提供一種核苷酸SFS，序列如SEQ ID NO. 1所示；該序列可以通 過人工合成的方法進行合成，也可以通過PCR和酶切的方法從棉花的基因組中進行克隆。
[0009] 第二方面，本發明提供一組用于擴增所述核苷酸SFS的外側引物對，所述外側引 物對的序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 第三方面，本發明提供一組用于擴增所述核苷酸SFS的內側引物對，所述內側引 物對的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
[0011] 第四方面，本發明提供一種重組載體，包含所述核苷酸SFS，如實施例1中的連接 核苷酸SFS的pMD18-T載體等。
[0012] 第五方面，本發明提供一種轉化體，包含所述核苷酸SFS，所述轉化體采用的宿主 為大腸桿菌或農桿菌。
[0013] 第六方面，本發明提供一種所述核苷酸SFS作為啟動子的用途。
[0014]優選地，所述用途具體為核苷酸SFS作為啟動子在驅動植物中目的基因在特定組 織中表達的應用；所述植物包括棉花、擬南芥；所述組織包括表皮、纖維等。
[0015] 優選地，所述核苷酸SFS作為啟動子在驅動植物中目的基因在特定組織中表達的 應用具體為用所述轉化體的懸浮液浸泡植物組織。
[0016] 優選地，所述用途具體為核苷酸SFS作為啟動子在植物育種中的應用。
[0017] 第七方面，本發明提供一種所述核苷酸SFS的制備方法，包括人工合成法或生物 克隆法；
[0018] 優選地，所述核苷酸SFS的人工合成的方法具體為：
[0019] 步驟一、根據核苷酸SFS的正鏈和副鏈序列，分別合成出長度150~200bp、具有粘 性末端的單鏈寡核苷酸正鏈片段和單鏈寡核苷酸副鏈片段；
[0020] 步驟二、將所述單鏈寡核苷酸正鏈片段和單鏈寡核苷酸副鏈片段分別退火，形成 帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段；
[0021] 步驟三、混合所述雙鏈寡核苷酸片段，經T4DNA連接酶催化組裝成一個完整的核 苷酸SFS。
[0022] 優選地，所述生物克隆法具體為：
[0023] 步驟1、提取棉花DNA ;
[0024] 步驟2、以所述DNA為模板，依次用所述外側引物、內側引物進行擴增；
[0025] 步驟3、將所述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即得核苷酸SFS。
[0026] 優選地，所述棉花為陸地棉。
[0027] 本發明首次采用分子克隆方法，從陸地棉（Gossypium hirsutum)基因組中分離獲 得了新的SFS啟動子，并且通過轉基因實驗證實了它具有種皮及纖維組織特異性，利用該 啟動子可以特異驅動基因在上述組織中高水平地轉錄表達，從而達到了本發明目的。
[0028] 本發明克隆分離組織特異表達啟動子SFS，并利用該啟動子在擬南芥中特異表達 報告基因以提高基因在特定組織的表達水平。
[0029] 本發明的SFS啟動子具有如下特性:A)在棉花和擬南芥組織的表達情況十分明 確，該啟動子在棉花等植物上沒有報道；B)結構新，在核酸水平上與已見報道的其它啟動 子無任何同源性，同源性位點不含有現有專利保護序列和突變位點。
[0030] SFS啟動子為提高基因在植物種皮、以及棉花纖維的衣分含量提供了新的途徑，因 而具有巨大的應用前景。
【附圖說明】
[0031] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0032]圖1是SFS啟動子遺傳轉化載體的構建示意圖；
[0033] 其中，LB、RB分別為T-DNA的左右邊界序列，SFS為本發明所特異表達啟動子，NOS 為終止子；
[0034]圖2是轉SFS啟動子轉化擬南芥的不同組織的⑶S染色分析圖；
[0035] 其中，A :根；B