一株米修鏈霉菌及其在防治核桃、冬棗炭疽病方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物應用領域。具體而言，本發明涉及一株米修鏈霉菌及其用途。
【背景技術】
[0002] 核桃是重要的經濟樹種，居世界四大堅果之首。核桃果仁含油量高達60 %~ 75%，蛋白質含量在15%左右；含有豐富的維生素和媽、鐵、梓等多種營養兀素，對防治心 血管病、防癌、補腦等方面有良好的功效。核桃種植具有重要的經濟效益、社會效益和生態 效益。全國各地正在大力推廣核桃種植。山東省核桃種植面積逐年上升，至2013年已達137 萬畝。冬棗為中國特有的晚熟棗品種，營養豐富，含有Vc、環磷酸腺苷、環磷酸鳥苷等，對人 類多種疾病具有良好的醫療保健作用。冬棗是黃三角流域主要經濟果木，也是當地的主導 產業之一，發展勢頭迅猛，僅沾化縣種植面積就達50萬畝，產量3億kg。但近年來，由于氣 候、品種及種植模式的原因，冬棗盲目追求產量，核桃以早實為主，抗病性較差；管理粗放或 矮化密植栽培方式使冬賽、核桃病害發生日趨嚴重。核桃炭疽病（Walnut anthracnose)、冬 賽炭疽病（winter jujube anthracnose)是由炭疽菌屬（Colletotrichum Corder)真菌引 起的一類重要病害，各核桃、冬棗產區均有發生，已成為制約核桃、冬棗產業快速健康發展 的主要障礙之一。
[0003] 炭疽菌屬真菌是一類重要的植物病原菌，全球性分布，寄主范圍廣，可以侵染許多 木本植物和禾本植物，特別是造成一些像草莓、芒果、柑橘、鱷梨等高檔水果以及香蕉等普 通水果的減產。由于其重要的科學及經濟價值，炭疽菌屬真菌是公認的全球第八類最重要 的植物病原菌。分布范圍十分廣泛，對全球農林業生產構成了嚴重威脅。
[0004] 關于核桃、冬棗炭疽病的防治，目前的防治方法就是盲目使用化學殺菌劑。長期使 用化學殺菌劑，帶來的一系列嚴重問題：農藥殘留、環境污染、抗藥性產生、傷及非靶標生物 以至于破壞生態平衡等。同時在植物病害的控制中，隨著病菌抗藥性的不斷形成與提高，以 及人們越來越擔心食物鏈中化學殘留物對健康的影響，要求降低果蔬產品用藥量的呼聲越 來越高，越來越多的化學殺菌劑使用受到了限制，有些已被明令禁止使用。核桃主要種植在 山區、丘陵，屬水分涵養區，長期大量使用化學農藥勢必污染土壤和水分，對當地及附近城 市居民用水安全造成嚴重威脅。因此，考慮到經濟、環境和安全等問題，這就迫使人們去尋 求新的安全有效的防治途徑。生物防治是有效的途徑之一，在病害的防治中能部分替代或 者完全替代化學殺菌劑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一株米修鏈霉菌菌株JT01，它可以用作生物農藥，用來防治 核桃、冬棗炭疽病，具有良好的應用前景。
[0006] 本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的：本發明所提供的菌株為米修鏈霉 菌（Streptomyces misionensis)菌株JT01，是從山東省青島市風河入海口沙灘土壤中采 用稀釋分離法分離獲得的，已于2013年9月03日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研宄所），保藏號為CGMCC No. 8126。其具有以下微生物學特性：在高氏一號培養基上氣 生菌絲呈白色至灰白色，基內菌絲呈淺黃至黃褐色，有乳白色色素產生。菌絲無橫隔，孢子 絲為開環鉤形或緊密螺旋形，孢子鏈狀排列，橢圓形，可以較好的利用L-阿拉伯糖和D-果 糖，淀粉水解、纖維素水解、牛奶凝固與液化等反應呈陽性，明膠液化、黑色素產生和纖維素 利用等反應呈陰性。該菌株的16S rDNA基因序列測定結果如SEQ-1所示。
[0007] 本發明提供了米修鏈霉菌菌株JT01的培養方法或繁殖方法：
[0008] (1)普通培養保存采用高氏一號培養基，配方為：可溶性淀粉20g，硝酸鉀lg，氯化 鈉〇? 5g，磷酸氫二鉀0? 5g，硫酸亞鐵0? Olg，硫酸鎂0? 5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH調至 7. 2-7. 4 ；
[0009] (2)實驗室液體培養采用高氏一號液體培養基，配方為：可溶性淀粉20g，硝酸鉀 lg，氯化鈉〇. 5g，磷酸氫二鉀0. 5g，硫酸亞鐵0. 01g，硫酸鎂0. 5g，蒸餾水1000mL，pH調至 7. 2-7. 4 ；
[0010] (3)固體培養基配方：固料和無機鹽溶液，按質量比0. 8 :1~1 :1的比例配制。 所述固料由質量比為55 :45的玉米芯和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液為： 0. 1 %硝酸鉀，0. 05%氯化鈉，0. 05%磷酸二氫鉀，0. 05%硫酸鎂，0. 001 %硫酸亞鐵，剩余為 水。
[0011] ⑷大量發酵培養配方：同⑶中固體培養基配方。
[0012] 本發明的另一個目的是提供一種含有上述米修鏈霉菌菌株JT01的微生物菌劑。
[0013] 上述米修鏈霉菌菌株JT01的微生物菌劑，由以下方法獲得：
[0014] (1)將保存的米修鏈霉菌菌株JT01轉移至高氏一號試管斜面中，置于培養箱26°C 恒溫培養5~7d ;
[0015] (2)將培養好的米修鏈霉菌菌株JT01用無菌水以體積比1:10稀釋，吸取lmL，置 于高氏一號液體培養基中，28°C搖床振蕩培養3~5d得到種子液；
[0016] (3)按體積比8%~12%的接種比例將種子液接種到固體發酵培養基中進行培 養，培養溫度28°C，培養時間5~7d，中間多次振蕩；
[0017] (4)大量固體發酵：將（3)的培養物用無菌水按1:15比例稀釋，并用滅菌紗布過 濾，去除粗渣，即為生產菌液，按體積比1:6的接種比例接種于大量發酵培養基；然后置于 發酵室（28°C和相對濕度80%以上）中發酵培養7~9d，即可得到發酵液，進一步干燥即可 得原粉（含量〇? 3億/g)。
[0018] 該微生物菌劑可以用作生物農藥，用于防治核桃、冬棗炭疽病。因此，又一方面，本 發明提供米修鏈霉菌菌株JT01或者其微生物菌劑用于防治核桃、冬棗炭疽病中的用途。
[0019] 本發明還提供一種用于防治核桃、冬棗炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽 病的核桃、冬棗施用米修鏈霉菌菌株JT01或者微生物菌劑。
[0020] 實驗表明，本發明的米修鏈霉菌菌株JT01具有菌株新穎、高效、活體菌含量高 的特點，其發酵原粉防治核桃炭疽病、冬棗炭疽病效果顯著，防治效果分別達到75. 65%、 73. 27%，且核桃、冬棗生長健壯，無藥害產生。同時具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能 減少化學農藥的使用，因而在生物防治核桃、冬棗炭疽病中具有重要應用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1為以16SrDNA序列為基礎的JT01菌系統發育樹。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0023] 實施例1米修鏈霉菌（Streptomyces misionensis)菌株JT01的分離與鑒定
[0024] 1 ?分離：
[0025] 本發明的米修鏈霉菌菌株JT01是從山東省青島市風河入海口沙灘土壤中采用土 壤稀釋分離法分離獲得的，分離方法為：
[0026] (1) 土樣采集：從土壤表層到15cm處取樣200g，一個地點采幾個樣本，混合過粗 篩，取25g作分離用；
[0027] (2)培養基平板制備：將200mL高氏一號培養基融化，加入0. lg/mL的重鉻酸鉀溶 液200 yL，配制成含有lOOppm重鉻酸鉀抑制劑的高氏一號培養基，倒入滅菌的培養皿中， 冷卻，制成平板；
[0028] (3)稱取lg 土樣于滅菌試管中，加100mL無菌水，振蕩，制成1(T2土壤懸浮液，靜 置5min，按10倍梯度稀釋到10，
[0029] (4)取上述土壤懸浮液500 UL，加入培養基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養箱 28°C恒溫培養5-7d。
[0030] (5)將單個菌落在高氏一號培養基上劃線，得到單菌落，轉移至高氏一號試管斜面 培養基中，至28 °C恒溫培養。
[0031] (6)以核桃炭疽病菌、冬棗炭疽病菌為靶標菌，采用對峙培養法，篩選到一株對核 桃炭疽病菌、冬棗炭疽病菌具有較強抑制活性的菌株，編號JT01。
[0032] 所述高氏一號培養基配方為：可溶性淀粉20g，硝酸鉀lg，氯化鈉0. 5g，磷酸氫二 鉀〇? 5g，硫酸亞鐵0? 01g，硫酸鎂0? 5g，瓊脂20g，蒸餾