一株高產次生代謝產物的尾孢屬內生真菌新種及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物領域中一株高產次生代謝產物的尾孢屬內生真菌新種及其應 用，所述次生代謝產物可為多糖、黃酮、三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種。
【背景技術】
[0002] 植物的代謝產物可分為兩類，即初生代謝產物和次生代謝產物。初生代謝產物是 指維持植物體正常生命活動所必需的物質和能量代謝，如脂類、氨基酸、核酸以及它們的多 聚體等，這些物質的分子量一般很大，又稱為大分子化合物。次生代謝產物是由次生代謝產 生的一類細胞生命活動或植物生長發育正常運行的非必需的小分子有機化合物（習慣上 稱為天然產物），其產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性，次生代 謝產物可分為苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、留體及其甙、生物堿七大類。在植物的 某個發育時期或某個器官中，次生代謝產物可能成為代謝庫的主要成分，比如橡膠樹產生 大量橡膠和甜菊葉中甜菊甙的含量可達干重的10%以上。
[0003] 植物中直接或間接的提取是目前人們獲得天然產物的主要手段，但隨著人口的增 多市場需求量的增加，直接從植物中提取次生代謝產物已經難以滿足需求，所以發展新的 高效生產這些重要的次生代謝產物方法迫在眉睫。內生真菌是在宿主體內生存并完成生活 周期的真菌，長期寄生在某種植物上的內生真菌通常能與該宿主植物協同演化，宿主植物 與其內生真菌之間可能存在基因重組的現象，從而使得宿主植物上的內生真菌能產生與宿 主植物相同的代謝產物。近年來發現的天然產物中有51 %來自植物內生真菌，38%來自土 壤微生物，11 %來自植物和動物，顯然內生真菌己成為天然產物的重要資源。
[0004] 野生碗豆生存環境原始、復雜，種群多樣性高，其內生真菌的豐富度及多樣性較其 它物種更為優越。通過對野生碗豆內生真菌的分離可得到一些較為原始及次生代謝產物多 樣的內生真菌。尾孢屬（Cercospora)真菌可導致草坪葉斑病，常見的有4種類型：引起翦股 穎葉斑病的翦股穎尾孢菌（C. agrostidis)、引起羊茅葉斑病的羊茅尾孢菌（C. festucae)、 引起野牛草和狗牙根葉斑病的C. seminalis和引起鈍葉草葉斑病的C. fusimaculans.。也 有關于尾孢菌作為水萌蘆生防菌的應用，但關于尾孢屬內生真菌次生代謝產物分析報道甚 少。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是如何利用微生物生產次生代謝產物，所述次生代謝 產物為多糖、黃酮、總三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供了一株可以產生次生代謝產物的內生真菌，所 述次生代謝產物為多糖、黃酮、總三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種。
[0007] 本發明提供的內生真菌是尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2,該菌株已于2014 年10月27日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：中國武漢武漢大學）， 保藏編號為 CCTCC NO :M 2014518。
[0008] 本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO ：M 2014518〇
[0009] 上述菌劑可為產生次生代謝產物多糖、黃酮、總三萜和總酚中的四種、三種、兩種 或一種的菌劑。
[0010] 所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可 為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、 礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培 養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述 組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒 劑。
[0011] 根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80等）、粘合劑、穩 定劑（如抗氧化劑）、pH調節劑等。
[0012] 所述尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 在生產次生代 謝產物多糖、黃酮、總三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種的應用也屬于本發明的保護 范圍。
[0013] 所述以尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 為活性成分 的菌劑在生產次生代謝產物多糖、黃酮、總三萜和總酚中的四種、三種、兩種或一種的應用 也屬于本發明的保護范圍。
[0014] 本發明的再一個目的是提供一種培養尾孢屬WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法。
[0015] 本發明所提供的培養尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 的方法，包括將尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 在用 于培養尾孢菌的培養基中培養的步驟。
[0016] 本發明的又一個目的是提供一種以尾孢屬WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518為活性成分的菌劑的制備方法。
[0017] 本發明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 作為活性成分，得到所述菌劑。
[0018] 對中國黑龍江省阿城區林場采集野生豌豆葉片內生真菌的分離，可能得到一些較 為原始以及次生代謝產物功能多樣的內生真菌。本發明分離篩選得到產生次生代謝產物的 尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518。
[0019] 實驗證明，尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2) CCTCC NO :M 2014518 菌絲體 (干重）生長速率為〇.22g/d，其菌絲體（干重）中多糖、黃酮、總三萜和總酚的含量分別為 74. 452mg/g、l. 250mg/g、4. 395mg/g和3. 343mg/g，在最適搖瓶發酵條件下發酵培養10天其 發酵液中黃酮、總三萜和總酚的含量分別為〇. 668mg/L、0. 633mg/L和2. 124mg/L。這表明該 菌株能產生多糖、黃酮、總三萜和總酚，在生產次生代謝產物方面具有重要應用。
[0020] 保藏說明
[0021] 菌種名稱：尾孢屬
[0022] 拉丁名：Cercospora sp. nov.
[0023] 菌株編號：WDL2
[0024] 保藏機構：中國典型培養物保藏中心
[0025] 保藏機構簡稱：CCTCC
[0026] 地址：中國武漢武漢大學
[0027] 保藏日期：2014年10月27日
[0028] 保藏中心登記入冊編號：CCTCC NO :M 2014518
【附圖說明】
[0029] 圖1為生長4天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. ) WDL2在10倍光學顯微鏡下的菌 絲形態。
[0030] 圖2為生長7天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2在40倍光學顯微鏡下的菌 絲形態。
[0031] 圖3為生長15天的尾孢屬（Cercospora sp. nov. )WDL2的菌落形態。
【具體實施方式】
[0032] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0033] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0034] 實施例 1、尾孢屬 WDL2 (Cercospora sp. nov. WDL2)CCTCC NO :M 2014518 的分離、 鑒定與保藏
[0035] 1、內生真菌WDL2的分離
[0036] 將野生豌豆葉片（采自中國黑龍江省阿城區亞溝林場）進行消毒。將氯霉素加入 2%麥芽粉瓊脂培養基使其含量為50mg/L，得到麥芽粉氯霉素平板；用PDA固體培養基制成 PDA固體平板。將上述消毒后的野生豌豆葉片切成0.5cm 2的小塊放在麥芽粉氯霉素平板上， 25°C黑暗培養5天。將從野生豌豆葉片組織切口邊緣處長出的內生真菌菌絲逐個用接種環 接至PDA固體平板上進行菌種純化。將篩選到的其中一株內生真菌命名為內生真菌WDL2。
[0037] 2、內生真菌WDL2的鑒定
[0038] 從以下幾個方面鑒定步驟一分離并純化得到的內生真菌WDL2 :
[0039]2. 1、形態學鑒定
[0040] 將處于對數生長期且菌落大小穩定，上述步驟一分離并純化得到的內生真菌WDL2 進行單菌落狀態觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、菌落表面狀態（是否平坦、突 起、褶皺、凹陷等）、菌落邊緣特征（是否整齊、不規則、放射狀等），產孢時間等。菌落外觀 形態特征采集使用佳能60D相機（18-200mm IS，日本），技術參數為：APS-C規格數碼單反； 1800萬有效像素；10倍光學變焦。
[0041] 對處于對數生長期的所述內生真菌WDL2，經涂片染色后采用光學顯微鏡觀察菌絲 的形態，包括菌絲的表面狀態、菌絲的顯微結構（如子座、分生孢子梗、分生孢子等）。菌落 顯微觀察使用正立生物顯微鏡Axioskop2plusFL(蔡司，德國），技術參數：消色差一消球差 多功能聚光鏡；照明系統為100W鹵素燈，柯勒照明；五檔熒光分光器；HB050, HB0103光源。 采用Axioplan 2imaging MOT軟件進行圖像采集與分析。
[0042] 結果表明（圖1、圖2和圖3)，上述步驟一分離并純化得到的內生真菌WDL2具有 如下形態特征：菌落凸起，正面白色，背面黑褐色，表面光滑，邊緣有褶皺，培養基變成黃色， 菌落厚2-3mm，用PDA固體培養基培養時生長較為緩慢，培養16天菌落直徑為4厘米。顯 微結構觀察顯示，具較大子座，子座近球形，直徑80 y m~160 y m。分生孢子梗單生或多根 密集簇生在子座上