用于檢測艱難梭菌的組合物和方法
【專利說明】用于檢測艱難梭菌的組合物和方法 發明領域
[0001] 本發明涉及微生物診斷的領域，并且更具體而言，涉及艱難梭菌（CAostrit/iwffi t/iiTicih)的檢測。
[0002] 發明背景 艱難梭菌（C/ostrit/itt? ￡/i//ici7e)( "艱難梭菌（C ￡/i//ici7e)" 或"艱難梭菌（C 沿//) "）是一種厭氧、革蘭氏陽性、形成孢子的細菌，其可引起嚴重的腹瀉和其他腸道疾病。 艱難梭菌孢子經常在醫院中發現，并且盡管孢子不能直接引起感染，但它們當被攝取時可 以轉化為活躍感染形式。艱難梭菌感染包括廣泛范圍的臨床癥狀，從簡單腹瀉到與顯著的 發病率和死亡率相關的假膜性結腸炎。抗生素相關的結腸炎是艱難梭菌引起的結腸感染， 其發生在腸道菌群中的競爭性細菌已經被抗生素清除時。它是患者當他們在醫院中時獲取 的最常見感染。
[0003] 大多數艱難梭菌感染發生在年齡為65歲或以上的人之間和衛生保健設施諸如 醫院和養老院中的患者之間。從1996年到2009年，年齡為65歲或以上的住院人的艱難 梭菌比率增加200%，其中年齡為65-74歲的那些增加175%，年齡為75-84歲的那些增加 198%，且年齡為85歲或以上的那些增加201%。年齡為85歲或以上的患者間的艱難梭菌比 率顯著高于其他年齡組的那些（全國醫院出院調查，年度檔案，1996年-2009年（National Hospital Discharge Survey, Annual Files, 1996-2009))〇
[0004] 診斷艱難梭菌結腸炎通常涉及檢測糞便樣品中由艱難梭菌產生的毒素的測試。存 在兩種不同的能夠引起結腸炎的艱難梭菌毒素，稱為毒素和毒素用于 這些毒素的診斷測試是可商購的。然而，這些測試不完美，并且可導致假陽性測試（當不存 在艱難梭菌時發現毒素），且可發生假陰性測試（當存在艱難梭菌時未發現毒素）。例如， 艱難梭菌和索氏梭菌（C sorofeT7ii)之間交叉反應的可能性是已知的。參見，"Cloning and characterization of the cytotoxin L-encoding gene ofClostridiumsordellii: homology withClostridiumdifficilecytotoxin B"，Green 等人，Gene, 1995, 161:57-61)。因此，仍然存在開發用于檢測艱難梭菌的分子測試的顯著臨床需要，所述分子 測試比培養更靈敏，且較不易于獲得假陽性或假陰性結果。
[0005] 發明概沐 本發明的實施方案涉及用于快速檢測生物或非生物樣品中艱難梭菌的存在或不存在 的方法。本發明包括包含進行至少一個循環步驟的艱難梭菌的檢測方法，所述循環步驟可 以包括擴增步驟和雜交步驟。此外，本發明涉及設計用于檢測艱難梭菌的引物、探針和試 劑盒。在本發明的方法中靶向用于檢測艱難梭菌的基因是艱難梭菌毒素B "《/功基因。 例如，選擇編碼細胞毒素B的基因，因為其被確定為對于產毒素的艱難梭菌是特異性 的，并且不存在于其他梭菌屬物種中，例外是索氏梭菌的一些腸毒素陰性、細胞毒素陽性的 菌株（Green,等人，J. Med. Microbiol. 1996，44:60-64)。產毒素的艱難梭菌菌種間 teoB基因的異質性導致多達31種毒素型，迄今包括Tox 0,這是參考菌株VPI 10463。化必 基因編碼具有負責結合宿主細胞膜的C-末端結構域、參與內化的中間部分和N-末端催化 (毒性）部分的單鏈蛋白（Rupnik,等人，Microbiology, 2005，151(1): 199-208)。
[0006] 在一個方面，本發明提供了用于檢測樣品中的艱難梭菌的方法，所述方法包括：進 行擴增步驟，所述擴增步驟包括使樣品與&必引物組接觸，如果艱難梭菌存在于樣品中， 則產生擴增產物；進行雜交步驟，所述雜交步驟包括使所述擴增產物與一種或多種可檢測 的^躲針接觸；和檢測所述擴增產物的存在或不存在，其中所述擴增產物的存在指示樣 品中艱難梭菌的存在，并且其中所述擴增產物的不存在指示樣品中艱難梭菌的不存在。在 一個實施方案中，化必引物組的每個引物包含選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5和6的核苷酸序 列或其互補序列，或由選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5和6的核苷酸序列或其互補序列組成；并 且其中所述一種或多種可檢測的針包含選自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或 其互補序列，或由選自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或其互補序列組成。在一些實施 方案中，雜交步驟包括使擴增產物與由供體熒光部分和相應的受體熒光部分標記的探針接 觸。該方法還可以包括檢測探針的供體熒光部分和受體熒光部分之間的熒光共振能量轉移 (FRET)的存在或不存在。熒光的存在或不存在指示樣品中艱難梭菌的存在或不存在。
[0007] 在一個方面，擴增可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。在某些方面， 第一和第二熒光部分可以沿著探針長度在彼此不超過5個核苷酸內。在另一個方面，化必 探針包括允許二級結構形成的核酸序列。此類二級結構形成通常導致第一和第二熒光部分 之間的空間接近。此方法的某些實施方案中，在探針上的第二熒光部分可以是猝滅劑。
[0008] 在另一個方面，本發明提供了檢測來自個體的生物樣品中艱難梭菌的存在或不存 在的方法。此類方法通常包括進行至少一個循環步驟，其包括擴增步驟和染料-結合步驟。 通常，所述擴增步驟包括使樣品與一對化必引物接觸，如果樣品中存在核酸分子，則 產生teoST增產物，并且所述染料-結合步驟包括使teoST增產物與雙鏈DNA結合染料接 觸。此類方法還包括檢測雙鏈DNA結合染料結合至擴增產物中的存在或不存在，其中結合 的存在指示樣品中存在艱難梭菌，并且其中結合的不存在指示樣品中不存在艱難梭菌。代 表性雙鏈DNA結合染料是溴化乙錠。此外，此類方法還可以包括確定teoST增產物與雙鏈 DNA結合染料之間的解鏈溫度，其中所述解鏈溫度證實艱難梭菌的存在或不存在。
[0009] 在進一步方面，本發明提供了用于檢測艱難梭菌的核酸目標）的試劑盒。所 述試劑盒可以包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1、2和3的序列 或其互補序列，或由選自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互補序列組成；第二寡核苷酸，所 述第二寡核苷酸包含選自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互補序列，或由選自SEQ ID N0:4、 5和6的序列或其互補序列組成；和第三可檢測地標記的寡核苷酸，所述第三可檢測地標記 的寡核苷酸包含選自SEQ ID N0:7、8和9的序列或其互補序列，或由選自SEQ ID N0:7、8 和9的序列或其互補序列組成。在某些實施方案中，第一和第二寡核苷酸是引物寡核苷酸， 而第三可檢測標記的寡核苷酸是探針寡核苷酸。
[0010] 在一個實施方案中，試劑盒可以包括已用供體和相應的受體熒光部分標記的探 針，或可以包括用于標記探針的熒光部分。在某些實施方案中，受體熒光部分是猝滅劑。該 試劑盒還可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶和核酸聚合酶功能所需的緩沖液中的至少一種。 該試劑盒還可包括關于使用引物、探針和熒光部分以檢測樣品中艱難梭菌的存在或不存在 的包裝說明書和使用說明書。
[0011] 在一個方面，本發明提供了寡核苷酸，其包含選自SEQ ID勵:1、2、3、4、5、6、7、8和 9的核苷酸序列或其互補序列，或由選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核苷酸序列 或其互補序列組成，所述寡核苷酸具有100個或更少的核苷酸。在某些實施方案中，寡核 苷酸具有40個或更少的核苷酸。在另一個方面，本發明提供了寡核苷酸，其包括與SEQ ID 勵:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互補序列具有至少70%序列同一性（例如至少75%、80%、 85%、90%或95%等）的核酸，所述寡核苷酸具有100個或更少，更具體地40個或更少的核 苷酸。在某些實施方案中，寡核苷酸與SEQ ID勵:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互補序 列具有90%序列同一性。通常，在這些實施方案中，這些寡核苷酸可以是引物核酸、探針核 酸等。在這些實施方案的某些中，寡核苷酸具有40個或更少的核苷酸（例如35個或更少 的核苷酸，30個或更少的核苷酸等）。在一些實施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的核 苷酸，例如以相對于未修飾的核苷酸改變核酸雜交穩定性。任選地，寡核苷酸包含至少一個 標記和/或至少一個猝滅劑部分。在一些實施方案中，寡核苷酸包括至少一個保守修飾的 變化。
[0012] 在又另一個方面，本發明提供了寡核苷酸引物對，其中第一寡核苷酸引物包含選 自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互補序列，或由選自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互 補序列組成，且其中第二寡核苷酸引物包含選自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互補序列， 或由選自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互補序列組成。在這些實施方案的某些中，所述 寡核苷酸中的至少一個具有40個或更少的核苷酸（例如35個或更少的核苷酸，30個或更 少的核苷酸等）。在一些實施方案中，所述寡核苷酸中的至少一個包含至少一個修飾的核苷 酸，例如，以相對于未修飾的核苷酸改變核酸雜交穩定性。在一些實施方案中，所述寡核苷 酸中的至少一個包括至少一個保守修飾的變化。
[0013] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通 技術人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本 發明的實踐或測試中，但是下文描述了合適的方法和材料。此外，材料、方法和實例僅是舉 例說明性的，并且不意圖是限制性的。
[0014] 本發明的一個或多個實施方案的細節在下文附隨的附圖和說明書中闡述。本發明 的其他特征、目的和優點根據附圖和詳述和權利要求將是顯而易見的。
[0015]附圖簡沐 圖1A、1B和1C顯示用針對艱難梭菌的毒素B基因的各種引物對產生的PCR產物的凝膠 數據，和與索氏梭菌的交叉反應性的水平；CDB203BZ/CDB202BZ (圖1A)，CDN211BZ/CDB214N (圖 1B)和 CDB205BZ/CDB204BZ (圖 1C)。
[0016] 圖2A、2B和2B顯示用各種引物對擴增艱難梭菌Tox 0和索氏梭菌的基因組DNA 中 CDB242HQ6 探針的 PCR 生長曲線：CDB203BZ/CDB202BZ (圖 2A)、CDN211BZ/CDB214N (圖 2B)和 CDB205BZ/CDB204BZ (圖 2C)。
[0017]發明詳沐 本文描述了用于檢測樣品中的艱難梭菌的實時測定。提供了用于檢測艱難梭菌的引物 和探針，以及含有此類引物和探針的制品或試劑盒。與其他方法相比較用于檢測艱難梭菌 的實時PCR增加的靈敏度，以及改善的實時PCR特征包括樣品污染（containment)和擴增 產物的實時檢測，使得這種技術用于在臨床實驗室中常規診斷艱難梭菌感染的實施可行。