用于改變活細胞中存在的目標rna分子的序列的寡核苷酸的制作方法
【專利說明】用于改變活細胞中存在的目標RNA分子的序列的寡核苷酸 發明領域
[0001] 本發明涉及基因治療領域，更具體地，涉及用于改變活細胞中存在的目標RNA分 子的序列的寡核苷酸。
【背景技術】
[0002] 許多種遺傳病是由基因組中的突變引起的。若干類型的修飾已經發現在基因組中 發生突變：一個或若干個堿基對的缺失、基因序列中的一個或若干個錯配、一個或若干個核 苷酸的插入、或重復三聯體的反復以及整個或一部分基因的缺失或重復。
[0003] 由一個或若干個堿基對的錯配、缺失或插入導致的遺傳病包括囊性纖維化、肌肉 萎縮癥、鐮狀細胞性貧血、血友病、0 -地中海貧血、脆性X綜合征。
[0004] 可以利用RNA修復在RNA水平上修復遺傳缺陷。
[0005] 寡核苷酸及其復合物已經被用作修復DNA修飾的治療分子（I Papaioannou，JP Simons, JS Owen, Oligonucleotide-directed gene-editing technology:mechanisms and future prospects (寡核苷酸引導的基因編輯技術：機制和未來展望），Expert Opin. Biol. Ther. (2012) 12 (3): 329-342)。這些寡聚物可以包含RNA和/或DNA核苷酸、或修飾的RNA 或DNA核苷酸。采用它們獲得缺陷DNA的位點特異性修復。預期修復在識別出引入的錯配 之后通過內源性DNA修復機制的激活進行。
[0006] 形成三聯體的寡核苷酸也已經被用作基因靶向的序列特異性工具。形成三聯 體的寡核苷酸在雙鏈體DNA的大溝中以高親和力結合。由于該特性，已經提出將形成三 聯體的寡核苷酸作為位點特異性修正革G向基因的工具（Knauert等人，Hum Mol Genet. (2〇01) 10,2243_225l;Richardson 等人，Drug Target(2〇〇2)10，l33_l34;Thoung 等 人，（1993)Angewandte Chemie. Inti. Ed. Eng.，32, 666-690.)。目前的革巴向基因修復方法不 是非常有效，而且/或者尚未證實在活細胞中原位發揮作用，為修復基因缺陷的其他機制 留下空間。
[0007] RNA水平上缺陷基因的修復已見諸報道。例如，采用通過雙鏈寡核苷酸復合物 的mRNA特定修復在體外在AF508CFTR mRNA中插入核苷酸。介導該過程的機制假定是 RNA 酶 H 介導的降解，然后是 RNA 修復（PC Zamecnik，MK Raychowdhury，DR Tabatadze，HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured A F508cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion (通過寡核苷酸插入在培養的AF508囊性纖維化跨膜傳導調節因子 細胞系中逆轉囊性纖維化表型），Proc Natl Acad Sci 2004101 (21)8150-8155 ; W02005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools (寡核苷酸復合物組合物及其用作基因變更工具的方法））。
【發明內容】
[0008] 本發明涉及用于活細胞中的靶向基因修復的方法，更優選地，在多細胞有機體中 (在體內）在活細胞中的靶向基因修復的方法。更具體地，本發明涉及在多細胞有機體中、 更具體地在動物中、更具體地在哺乳動物中、再更具體地在人中在體內改變活細胞中的目 標RNA。盡管有更早的活細胞中基因修復的報道，但據信本發明首次公開了使用寡核苷酸、 優選單鏈寡核苷酸、更優選單鏈寡核糖核苷酸、再更具體地為化學修飾的單鏈寡核糖核苷 酸在體內改變活細胞中的目標RNA分子、從而改變該有機體的表型的可能性。出人意料地， 根據本發明的寡核苷酸可以以基本上恢復受試者有機體患病表型的量在體內不喪失活性 地進行給藥。本發明通過如下示例：將能夠恢復編碼CFTR的RNA序列、從而恢復CFTR蛋白 質功能并恢復CF表型或者至少減輕有機體病情的經化學修飾的寡核糖核苷酸給予患有囊 性纖維化的有機體的肺中。因此，本發明涉及寡核苷酸，優選為單鏈反義寡核苷酸；包括該 寡核苷酸的組合物；包括該寡核苷酸和藥學可接受載體的藥物組合物；該寡核苷酸或組合 物用于在體內或體外進行RNA修復和/或改變目標RNA分子的序列的用途和方法；該寡核 苷酸或組合物用于與（遺傳）病有關或與基因突變有關的疾病的治療或預防，包括將該寡 核苷酸或組合物給予受試者、優選人受試者；以及包括將該寡核苷酸或組合物給予受試者、 優選人受試者的用于治療或預防與（遺傳）病有關或與基因突變有關的疾病的方法。在將 該優選為單鏈反義的寡核苷酸引入到細胞、優選哺乳動物細胞、更優選人細胞中時，將其在 RNA需要被修復、并有可能起到RNA修復的指導鏈作用的位置處引向RNA或其前體或其模 板。具體的修復機制尚未知曉，但根據本發明的優選為單鏈修復分子的寡核苷酸優選在修 復過程中不允許RNA酶H發揮作用。在目標RNA中介導的變化可以直接體現在RNA水平上 或者經由隨后轉錄成RNA分子的DNA或其前體間接體現。在此所述的寡核苷酸通常稱作本 發明的寡核苷酸，并可以用于本發明的所有實施方式中。
[0009] 本發明的所有實施方式均可以在體外、在體內或離體進行（在方法或用途的情況 下）或使用（在化合物或組合物的情況下）。
[0010] 本發明可以方便地用于治療囊性纖維化，優選地通過修復CFTR(囊性纖維化跨 膜轉導調節因子）外顯子10中的AF508突變。根據本發明的一示例性寡核苷酸一一 SEQ ID NO: 1所示分子的作用方式描繪于圖1-3和7A中。根據本發明的一示例性寡核苷 酸--SEQ ID NO: 1所示分子相比較于之前所述的雙鏈體（Zamecnik等人，同上）的活 性描繪于圖4中。附圖表明，與之前所述的雙鏈體分子相比較，當前所述的單鏈反義寡核 苷酸（AON)在修復CFTR方面至少具有相同的活性，并且似乎活性更強（PC Zamecnik，MK Raychowdhury, DR Tabatadze, HF Cantiello Reversal of cystic fibrosis phenotype in a cultured A F508cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cell line by oligonucleotide insertion(通過寡核苷酸插入在培養的AF508囊性纖維化跨膜傳導 調節因子細胞系中逆轉囊性纖維化表型），Proc Natl Acad Sci 2004 101(21)8150-8155; W02005094370, oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools (寡核苷酸復合物組合物及其用作基因變更工具的方法）hSEQ ID NO: 1 的活性使用Zamecnik等人在同上文獻中所述的比較試驗測定，尤其是參見第8153頁圖4。
[0011] 本發明還可以方便地用于改變其他目標RNA分子和/或治療與（遺傳）病相 關的其他疾病，例如但不限于，白化病、a-1-抗胰蛋白酶缺乏、阿爾茨海默氏癥、肌萎 縮性脊髓側索硬化癥、哮喘、地中海貧血、Cadasil綜合征（Cadasil syndrome)、腓 骨肌萎縮癥、慢性阻塞性肺病（C0PD)、遠端型脊肌萎縮癥（DSMA)、杜氏/貝氏肌營養不 良（Duchenne/Becker muscular dystrophy)、營養不良型大皰性表皮松懈（Dystrophic Epidermolysis bullosa)、大皰性表皮松懈、法布里病（Fabry disease)、家族性腺瘤 (Familial Adenomatous)、息肉病、半乳糖血癥、戈謝病（Gaucher，s Disease)、葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、血友病、遺傳性血色病、亨特氏綜合征、亨廷頓氏舞蹈病、賀勒氏癥 (Hurler Syndrome)、炎癥性腸病（IBD)、遺傳性多凝聚反應綜合征、萊施-奈恩綜合征 (Lesch-Nyhan syndrome)、Lynch 綜合征、馬凡綜合征（Marfan syndrome)、黏多糖病、肌 肉萎縮癥、I型和II型肌強直性營養不良、A、B和C型尼曼-匹克病、NY-esol相關癌癥、 帕金森氏病、黑斑息肉綜合征（Peutz-Jegher syndrome)、苯丙酮尿癥、龐帕病（Pompe's disease)、原發性纖毛疾病（Primary Ciliary Disease)、肺性高血壓、色素性視網膜炎、山 霍夫氏病（Sandhoff Disease)、重癥聯合免疫缺陷綜合征（SCID)、鐮狀細胞性貧血、脊髓型 肌萎縮癥、斯特格氏病（Stargardt's Disease)、泰-薩氏病（Tay-Sachs disease)、X連鎖 免疫缺陷病、各種形式的癌癥（例如BRCA1和BRCA2相關的乳腺癌和卵巢癌）等。
[0012] 根據本發明一優選實施方式，目標RNA序列的變化包括將一個或多個核苷酸插入 到目標RNA中。在更優選的實施方式中，插入一個或多個核苷酸導致在由目標RNA序列編 碼的多肽序列中插入至少一個氨基酸序列。根據最優選的實施方式，插入氨基酸序列導致 編碼的多肽在多細胞有機體中恢復成正常發揮功能的多肽。因此，在本發明最優選的實施 方式中，多細胞有機體中的目標RNA序列與目標RNA序列功能失常導致的疾病有關，并且遺 傳病選自因目標RNA序列與正常發揮功能的目標RNA序列相比缺少一個或多個核苷酸而導 致的疾病。優選地，根據本發明，目標RNA序列缺少密碼子的至少一部分，其通過使用根據 本發明的寡核苷酸改變RNA序列得以恢復。
[0013] 本發明表明，RNA修復可以通過根據本發明的寡核苷酸的全身給藥在體內完成。取 決于與疾病有關的組織或器官，或者更一般地為要實現目標RNA改變的對象，給藥方式可 以加以修改，以優化根據本發明的寡核苷酸的遞送。對于肺病和其他呼吸疾病，根據本發明 的寡核苷酸可以方便地直接給予肺，例如，通過吸入。另外可選地，取決于疾病和/或目標 組織，給藥可以局部（例如，在皮膚上）或全身進行，例如，皮內、皮下、肌內、靜脈內、口服、 直腸、顱內給藥等。
[0014] 根據本發明的寡核苷酸可以含有DNA-或RNA-核苷酸；可以存在有修飾的DNA-或 RNA-核苷酸，以提高穩定性，如本文別處所述。根據本發明的寡核苷酸可以包括，例如肌苷， 并且/或者包括修飾的核苷酸，優選選自2' -0-烷基核糖、2' -0-甲基核糖、2'氟核糖、硫 代磷酸酯、甲基膦酸酯、PM0、5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶。穩定化核苷酸的一種這 樣的優選例子是2' -0-甲基修飾的核苷酸，另一例子是鎖核酸（LNA)核苷酸和/或肽核酸 (PNA)。其他提高穩定性的措施可以是，例如，核苷酸之間的硫代磷酸酯連接。根據本發明 的寡核苷酸可以根據本領域已知的任何方法制備。本領域技術人員知曉如何合成根據本發 明的寡核苷酸。
[0015]因此，根據本發明的寡核苷酸優選加以化學修飾，以耐受核酸內切酶、核酸外切酶 和RNA酶H，并促進（RNA)結合和雙鏈體穩定性。所選擇化學性的具體特性至少部分地影 響根據本發明的寡核苷酸向目標的遞送：給藥途徑、生物穩定性、生物分布、組織內分布以 及細胞攝取和運輸。此外，可以應用寡核苷酸化學性質的進一步優化，以提高結合親和力和 穩定性，提高活性，提高安全性，并/或通過減少長度或改進合成和/或提純方法而降低商 品成本。多種化學修飾是本領域技術人員常用的和/或市售的（例如，2' -0-甲基RNA和 5-取代的嘧啶和2, 6-二氨基嘌呤）。
[0016] 根據本發明的寡核苷酸可以具有至少一個骨架，和/或糖修飾和/或至少一個堿 基修飾。
[0017] 堿基修飾包括天然嘌呤和嘧啶堿基（例如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺 喃啶）的修飾形式，例如，次黃嗓呤、乳清酸、agmatidine、賴胞苷、2-硫代喃啶（例如，2-硫 代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶）、G形鉗（G-clamp)及其衍生物、5-取代的嘧啶（例如，5-鹵代 尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-氨基 甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、Super T)、7_脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、7-氮雜-2, 6-二 氨基嘌呤、8-氮雜-7-脫氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-脫氮腺嘌呤、8-氮雜-7-脫氮-2, 6-二氨 基嘌呤、Super G、Super A和N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-環戊基鳥嘌呤（cPent-G)、 N2-環戊基-2-氨基嘌呤（cPent-AP)和N 2-丙基-2-氨基嘌呤（Pr-AP)或其衍生物；和簡并 或通用的堿基，如2, 6-二氟甲苯，或缺堿基，如脫堿基位點（abasic site)(例如，1-脫氧核 糖、1，2-二脫氧核糖、1-脫氧-2-0-甲基核糖；或其中環氧已被氮取代的吡咯烷衍生物（脫 氮核糖））。Super A、Super G和Super T衍生物的例子可見于US專利6, 683, 173 (Epoch Biosciences)，在此將其全文并入作為參考。cPent-G、cPent-AP和