基因、微生物、轉換方法及制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基因、微生物、轉換方法及制造方法。
【背景技術】
[0002] 近些年，從化石資源枯竭或全球變暖對策等觀點來看，以可再生資源為原料的化 合物制造工藝受到了關注。特別是，以生物質作為原料的、利用生物化學工藝來制造各種聚 合物原料化合物或化學品原料化合物的、所謂的生物煉制被廣泛研宄。
[0003] 作為被期待進行生物質的原料轉化的化合物，可舉出丁二醇（指1，3-丁二醇及 1，4-丁二醇）。例如，1，4-丁二醇被用作精密有機化學品的合成原料、聚酯及工程塑料的單 體單位等，1，3- 丁二醇被用作有機溶劑或化妝品基質等。無論1，4- 丁二醇還是1，3- 丁二 醇的情況，均對于以生物質等可再生資源為原料的生物化學工藝的要求變大。
[0004] 作為利用生物化學工藝的丁二醇的制造方法，例如可舉出專利文獻1~3及非專 利文獻1記載的方法。
[0005] 專利文獻1 :(日本）專利第4380704號公報
[0006] 專利文獻2 :國際公布2008/115840號公報
[0007] 專利文獻3 :國際公布2010/127319號公報
[0008] 非專利文獻 1 :Harry Yim et al.，Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1，4-butanediol，Nature Chemical Biology，7, 445-452 (2011).
【發明內容】
[0009] 〈本發明所要解決的技術問題〉
[0010] 然而，專利文獻1~3及非專利文獻1記載的方法的工藝復雜。
[0011] 針對上述問題，要提供一種新的1，4- 丁二醇的制造方法，其能夠經濟地獲得丁二 醇。另外，提供與該制造方法關聯的轉換方法、以及能夠適用于該制造方法及該轉換方法的 基因、微生物。
[0012] 〈用于解決技術問題的方案〉
[0013] 作為本發明人為解決上述問題而進行積極研宄的結果，發現了特定的基因較有 效，并得到本發明。換言之，本發明包括以下內容。
[0014] [1] 一種基因，其為下述（a)~（c)中任一項所述的基因：
[0015] (a)具有序列號1的喊基序列的基因；
[0016] (b)具有在序列號1的堿基序列中缺失、取代或插入一個或多個堿基的堿基序列 的基因，其中該基因具有相對于序列號1的喊基序列的90%以上的同一性的喊基序列；
[0017] (c)在嚴格條件下將具有序列號1記載的堿基序列的基因與具有互補的堿基序列 的基因雜交的基因，
[0018] 其中，所述基因通過與編碼烯酰CoA水合酶的基因組合，從而能夠對微生物或該 微生物的培養物賦予將3-羥基丁酰CoA轉換成4-羥基丁酰CoA、或將4-羥基丁酰CoA轉 換成3-羥基丁酰CoA的能力。
[0019] [2]根據[1]所述的基因，其中，所述微生物是大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌、或梭菌。
[0020] [3] -種微生物，其包括根據[1]所述的基因、以及編碼烯酰CoA水合酶的基因。
[0021] [4]根據[3]所述的微生物，其中，所述微生物還包括編碼酰基CoA還原酶的基因。
[0022] [5] -種轉換方法，其利用根據[3]所述的微生物或該微生物的培養物，將3-羥基 丁酰CoA轉換成4-羥基丁酰CoA、或將4-羥基丁酰CoA轉換成3-羥基丁酰CoA。
[0023] [6] -種制造方法，其利用根據[4]所述的微生物或該微生物的培養物來制造 1，4_ 丁二醇。
[0024] [7]根據[6]所述的制造方法，其中，所述微生物包含編碼乙酰乙酰CoA合酶或乙 酰乙酰CoA還原酶中的至少一者的基因。
[0025] [8]根據[6]所述的制造方法，其中，從乙酰CoA經由3-羥基丁酰CoA來制造 1，4_ 丁二醇。
[0026] 〈發明的效果〉
[0027] 能夠提供一種經濟的1，4- 丁二醇的制造方法。另外，能夠提供與該制造方法關聯 的轉換方法、以及能夠適用于該制造方法及該轉換方法的基因、微生物。
【附圖說明】
[0028] 圖1是用于對本實施方式的3-羥基丁酰和4-羥基丁酰之間的轉換方法進行說明 的概要圖。
【具體實施方式】
[0029] 以下，使用圖1對本發明進行詳細說明。需要說明的是，在本說明書中，"CoA"意 味著輔酶A。
[0030] (基因）
[0031] 首先，對本實施方式的基因進行說明，該基因通過與編碼烯酰CoA水合酶的基因 組合，從而能夠對微生物或該微生物的培養物賦予將3-羥基丁酰CoA轉換成4-羥基丁酰 CoA、或將4-羥基丁酰CoA轉換成3-羥基丁酰CoA的能力。
[0032] 本實施方式的基因是具有序列號1的堿基序列的基因和其同源物。本實施方式的 基因通過與編碼烯酰CoA水合酶的基因組合并通過轉化而在微生物體內表達，從而能夠應 用到例如3-羥基丁酰和4-羥基丁酰之間的轉換方法、或1，4- 丁二醇的制造方法。
[0033] 本實施方式中的同源物（homolog)包括直系同源物和旁系同源物。直系同源物是 指在從共同祖先的基因分化而生成的種類之間對應的基因及由該基因得到的酶的組合。旁 系同源物是指在同種內，在不是通過分化而是通過基因重復而生成的種類之間對應的基因 及由該基因得到的酶的組合。同源物是指與直系同源物、旁系同源物無關地、在序列上具有 同一性的基因及由該基因得到的酶。
[0034] 具體來說，具有序列號1記載的堿基序列的基因的同源物基因包括含有與序列號 1記載的堿基序列具有90%以上的同一性、優選95%以上的同一性的堿基序列的基因，更 優選是缺失、取代或插入了一個或多個該基因的堿基的基因。
[0035] 另外，該同源物基因包括在嚴格條件下將具有序列號1記載的堿基序列的基因與 具有互補的堿基序列的基因雜交的基因。具體來說，通過應用針對公知的數據庫的同源性 檢索程序（例如BLAST、FASTA)、或基于在利用由認定基因的至少一部分構成的探針（由該 基因的堿基序列構成的DNA和由互補的堿基序列構成的DNA)的嚴格條件下的雜交或聚合 酶鏈反應（PCR)等常規方法，能夠取得基因（或由該基因的轉化得到的酶）。另外，只要是本 領域的技術人員，就能夠通過對堿基序列進行取代，來親自進行設計。需要說明的是，作為 在此所說的嚴格條件，例如可以舉出非專利文獻Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(Joseph Sambrook, David ff.Russell. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)中記載的進行雜交的條件。具體來說，是在包含6 XSSC (IX SSC的組成：為0. 15M氯 化鈉、0. 015M 檸檬酸鈉，pH:7. 0)、0. 5% SDS、5XDenhardt 溶液及 100mg/mL 鯡魚精子 DNA 的溶液中，與探針一起在65°C下保持恒溫8~16小時，進行雜交的條件。
[0036] (微生物）
[0037] 作為能夠導入本實施方式的基因及編碼烯酰CoA水合酶的基因的轉化宿主微生 物的例子，只要是能夠使用基因重組技術的微生物，便無特別限定。從產業利用的觀點來 看，作為具體例子，可以舉出大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌、或梭菌屬細菌。作為酵母，可舉出 釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母等。作為棒狀桿菌，可舉 出谷氨酸棒桿菌、有效棒桿菌（Corynebacterium efficiens)、短桿菌（Brevibacterium divaricatum)、糖短桿菌、immariophilum 短桿菌（Brevibacterium immariophilum)、乳 發酵短桿菌、玫瑰色短桿菌、黃色短桿菌、生硫短桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌、醋谷棒桿菌、帚 石南棒桿菌、百合棒狀桿菌、mellassecola棒狀桿菌（Corynebacterium mellassecola)、 嗜氨微桿菌等。作為梭菌，可舉出克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、氨基酪酸梭菌、拜氏梭菌、 saccharoperbutylacetonicum 梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum)等。其 中，由于使用大腸桿菌、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母，或谷氨酸棒桿菌容易進行轉化，因此優選 使用，更優選使用大腸桿菌。
[0038] 另外，本實施方式的轉化微生物可以用于微生物培養菌體本身或其培養物的各種 形態。具體來說，本實施方式中的微生物的培養物包含微生物培養菌體的培養基或由緩沖 液等介質構成的懸濁物、來自微生物培養菌體的無細胞抽出液、以及從該無細胞抽出液濃 縮、精煉或提取對該反應進行催化的成分的處理物等處理物。本實施方式中的微生物的培 養物還包含將該微生物的處理物固定在難溶性的載體上的物質。作為該類固定載體，可以 舉出聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯基甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亞胺、甲基纖維素、葡 甘露聚糖、藻酸鹽、角叉菜膠等、以及其共聚物或交聯化物等、形成封裝了該微生物菌體或 其處理物的水難溶性的固體含量的化合物。其可以單獨使用一種，也可以混合使用兩種以 上。另外，活性炭、多孔陶瓷、玻璃纖維、多孔聚合物成型體、硝化纖維素膜等、在預先作為固 形物形成的物體上保持微生物或者其提取液或提取成分的物體也可以被用作微生物的培 養物。
[0039] (轉換方法）
[0040] 如上所述，本實施方式的基因通過與編碼烯酰CoA水合酶的基因組合并通過轉化 而在微生物體內表達，從而能夠應用到3-羥基丁酰和4-羥基丁酰之間的轉換方法。
[0041] 圖1表示出用于對本實施方式的3-羥基丁酰和4-羥基丁酰之間的轉換方法進行 說明的概要圖。如果向下述微生物體內供給3-羥基丁酰CoA，則通過該基因的作用，羥基 (0H基）發生重排反應，3-羥基丁酰CoA被轉換成4-羥基丁酰C〇A(S105及S107)。另外， 如果向該微生物體內供給4-羥基丁酰CoA，則通過該基因的作用，0H基發生重排反應，4-羥 基丁酰CoA被轉換成3-羥基丁酰CoA。
[0042] 序列號1所示的基因的針對氨基酸序列的翻譯結果、與可參見GenBank的 登記號AJ250267的源于氨基酪酸梭菌（Clostridium aminobutyri