檢測血清中HSP60 mRNA轉錄水平的RT-PCR引物、評估高血糖人群并發腸癌易感性的試劑 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種引物、試劑盒W及評估高血糖人群并發結直腸癌易感性的方法； 尤其涉及一種檢測血清中HSP60 mRNA轉錄水平的RT-PCR引物、用于評估高血糖人群并發 結直腸癌易感性的RT-PCR試劑盒及評估高血糖人群并發結直腸癌易感性的方法。屬于實 時英光定量逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒開發與人體病理學相結合的技術領域。
【背景技術】
[0002] 據世界衛生組織（WHO)統計，全世界逾2. 2億人患有糖尿病，2004年有340萬人 死于高血糖引發的嚴重并發癥，至2030年因患糖尿病而死亡的人數將再增加一倍。在年齡 ^ 20歲的中國人群中，糖尿病和糖尿病前期患病率分別為9. 7%和15. 5%，W此推算目前中 國有近一億成年人患有糖尿病，約1. 5億成年人處于糖尿病前期，中國已成為世界上糖尿 病患者最多的國家。
[0003] 結直腸癌（colorectal cancer, CRC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，全球 每年約100萬新發病例，在惡性腫瘤發病率居第3~5位，并呈逐年上升趨勢；其死亡率約 為20. 51%，居第4~5位；我國結直腸癌每年新發病例高達13萬~16萬人，目前患病率已 經高達69. 9/10萬，已經成為中國H大癌癥之一，全國腫瘤登記中也發布的《2012中國腫瘤 登記年報》統計結直腸癌已達腫瘤發病率、死亡率的第五位，并逐年升高。
[0004] 國內外多項流行病學證實糖尿病與結直腸癌發病率及預后密切相關，高血糖狀態 被認為是結直腸癌發病及進展的重要危險因素之一。糖尿病尤其是2型糖尿病與結直腸癌 具有諸多共同的發病風險因素，如服胖、高熱量飲食、缺乏運動等。對于某些高血糖人群(尤 其是T2DM患者)可能已成為易患結直腸癌的高危人群。長期的高血糖狀態可能通過激活某 些基因表達，進而參與了結直腸癌的發生發展。因此，篩選出可用于高血糖人群并發結直腸 癌易感性預警、病程及預后評估的糖尿病并發結直腸癌分子標志物，進而進行有針對性地 早診早治，對腫瘤患者的病程及預后判斷、治療方案制定、生存率提高及生活質量的改善均 具有重要意義。
[0005] 1983 年My llis 發明了聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR)技術。 PCR技術是一種體外核酸擴增技術，具有特異、敏感、產率高、快速、簡便等突出優點。應用 PCR技術可W使特定的基因或DNA片段在很短的時間內體外擴增數十萬至百萬倍。由于該 項技術具有簡便快速、特異性和靈敏度高、重復性好等突出優點，因此被廣泛應用于基礎研 究和臨床診斷。但是傳統的PCR技術在應用中存在著不能對特定mRNA進行準確定量，W 及操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，因此不能夠滿足實際工作需要，使其應用 受到限制。
[0006] 隨著實時英光定量PCR (real time quantitative PCR, qPCR)的出現，人們可W 真正做到對PCR樣本中微量mRNA的精確定量。qPCR是在PCR反應體系中加入英光基團，利 用英光信號累積實現實時監測整個PCR進程，并能對起始模板進行定量分析。RT-PCR需要 英光探針參與，在PCR的反應體系中加入一對含有待測基因特定堿基的引物序列，該引物 序列能與模板核酸發生特異性雜交。PCR每復制一個核巧酸片段，就有一個英光信號被釋 放出來，產物與英光信號產生一對一的對應關系。隨著產物的增加，英光信號亦隨之增強， 當信號增強到某一闊值時(根據英光信號基線的平均值和平均標準差，計算出99. 7 %的置 信度大于平均值的英光值，即為闊值)，此時的循環次數即循環闊值Ct (cycle t虹eshold， Ct)被記錄下來。該循環參數Ct和PCR體系中起始模板數的對數之間有嚴格的線性關 系。利用不同梯度的陽性定量標準模板擴增的Ct值和該陽性定量標準的模板數經過對數 擬合制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值就可W準確的確定起始模板的數量，因此根據 PCR產物的英光強度即可計算出初始模板的數量。實時英光定量PCR具有特異性強、靈敏 度高、定量準確、操作安全等優點，使用該方法擴增特異性mRNA，是一種高靈敏度、高特異 性、操作簡便的方法。
[0007] 因此，本領域迫切希望利用RT-qPCR技術將高血糖人群的狀態予W監控，屆時將 容易地評估高血糖人群并發結直腸癌的易感性及預后，有助于糖尿病并發結直腸癌患者的 早期預警、早診早治、預后評估，對于降低我國糖尿病、結直腸癌的高發病率、高致死率具有 重大的應用價值。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提供了檢測血清中服P60 mRNA轉錄水平的 RT-PCR 引物。
[0009] 本發明解決上述問題的技術方案如下： 檢測血清中服P60 mRNA轉錄水平的RT-PCR引物： 引物 F ;5, -ATCAGGAGAGGTGTGATGTTAG-3,；引物 R ;5, - TCCGTTTGCAGAAATCGTAG -3,。
[0010] 本發明的還提供了另一種技術方案，如下： 檢測血清中HSP60 mRNA轉錄水平用于評估高血糖人群并發結直腸癌易感性的RT-PCR 試劑盒，包含上述RT-PCR引物。
[0011] 作為上述技術方案的優選，還包含內參引物，所述內參引物如下： 引物 F ;5' -CACCCACTCCTCCACCTTTG-3' ； 引物 R ;5' -CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
[0012] 作為上述技術方案的優選，還包含RNA提取試劑、逆轉錄試劑和PCR反應液； 所述RNA提取試劑的組分及濃度如下；Trizol試劑355~800ml、氯仿200~400 y L、 異丙醇600~1000 y L、無水己醇1. 75~5. 00血、DEPC水290~1000 y L ; 所述逆轉錄試劑組分及濃度如下；150~250U/y L逆轉錄酶2 y L、4~6 X逆轉錄緩 沖液 4uL、12 ~50 mmol/L dNTPs 4uL、0. 1 ~1.2mol/L DTT 2y L、35 ~45U/UL RNA 酶 抑制劑0. 5 y L ; 所述PCR反應液組分及濃度如下；Syber Green I英光核酸染料25 y L、DM聚合酶 100U/ml、dNTPs 0. 2 mmol/L、氯化鎮 6 mmol/L、H輕甲基氨基甲焼鹽酸鹽 16. 5 mmol/L、氯 化鐘 89. 3 mmol/L、DEPC 水 50 y L ~60 y L。
[0013] 作為上述技術方案的優選，所述Trizol試劑具體為；重蒸苯酷200mL、8-羥基唾晰 0. 2g、目-琉基己醇1. 2g /二硫蘇糖醇0. 5g、異硫氨酸脈lOOg、蒸觸水118血、0. 75M 巧樣酸軸7. 04血、10%十二烷基肌氨酸軸10. 56血和2M醋酸軸20血。
[0014] 作為上述技術方案的優選，逆轉錄反應體系如下： 引物F luL、 引物R luL、 RNA 模板 2 y L、 逆轉錄酶 2uL、 5 X逆轉錄緩沖液 4]iL、 25mM dNTPs 4 y L、 0. 1 M DTT 2y L、 RNA酶抑制劑 0. 5 y L DEPC水 余量 總體積 20 uL。
[0015] 作為上述技術方案的優選，擴增體系如下： 引物F luL、 引物R luL、 cDNA 模板 2 y L、 SYBR Green I英光核酸染料 2 y L DEPC水 余量 總體積 50 uL。
[0016] 本發明的再一個目的是提供通過檢測血清中服P60 mRNA轉錄水平來評估高血糖 人群并發結直腸癌易感性的方法，其技術方案如下： 通過檢測血清中服P60 mRNA轉錄水平來評估高血糖人群并發結直腸癌易感性的方法， 包括W下步驟： 一、 血清總RNA的提取 (1) 收集評估對象的清晨空腹外周靜脈血5ml，置于冷凍離也機中，4C下調整轉速 2500-3000 r/min，離也8-lOmin后用無菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; (2) 將上述血清加入含有1血Trizol試劑的勻漿管中，于勻漿機勻漿20sec，立即放于 冰上； (3) 置于超凈臺中，溫育5min, 12000r/min，離也lOmin ; (4) 吸上清于新的1. 5血離也管中，加入200y L的氯仿，搖勻，室溫靜置2min，4°C， 12000;r/min，離也 lOmin ; (5) 吸取上清于新的1. 5血離也管中，加入600 y L的異丙醇，混合均勻，室溫靜置 15min，4°C，12000r/min，離也 15min,棄上清； (6) 加入1血75%的無水己醇漂洗沉淀，4°C，12000r/min，離也5min，棄上清；所述75% 的無水己醇的組成為750 y L無水己醇+250 y L DEPC水； (7) 加入1血無水己醇，漂洗沉淀，4°C，12000r/min，離也5min，棄上清，室溫干燥 lOmin ； (8) 加入40 y L的DEPC水溶解RNA，置于-8(TC冰箱保存備用； 二、 逆轉錄合成cDNA 采用上述RT-PCR試劑盒進行逆轉錄，反應程序；42°C，50min ;85°C，5min ;反應結束后 離也，置于-2(TC保存； H、Rea]_-time PCR 擴增 采用上述