板栗過敏原的恒溫擴增檢測引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術及食品安全檢測領域，涉及食品中過敏原成分的檢測 方法，具體涉及板栗過敏原的恒溫擴增檢測引物、試劑盒及方法。
【背景技術】
[000引板栗又名栗、中國板栗，是殼斗科栗屬的植物。板栗是 常見的、廣泛食用的樹生堅果，板栗引起的過敏癥狀包括面部紅腫、眼睛痛、紅、癢、専麻疹、 哮喘、嘴唇紅腫、惡也反胃、腹痛、低血壓、頭暈等癥狀，因而屬于食品過敏原標識管理的重 要種類。國際食品法典委員會制定的國際標準CODEX STAN 1-1985《預包裝食品標簽通 貝1J》明確規定了樹生堅果及其產品必須在預包裝食品標簽上予W聲明。在國際標準的基礎 上，世界各國紛紛頒布了各自的法規標準，對樹生堅果過敏原成分的標識管理進行了詳明 的規定。歐盟委員會指令2007/68/EC和美國《食品過敏原標識和消費者保護法案》（The Food Allergen L油eling and Consumer Protection Act, FALCPA)均明確規定樹生堅 果屬于必須明確標識的食品過敏原。我國在各級食品標準中也做出了類似的規定，例如《 GB 7718-2011預包裝食品標簽通則》、《GB/T 23779-2009預包裝食品中的致敏原成分》、《 DB11/Z 521-2008奧運會食品安全食品過敏原標識標注》、《DBJ 440100/T 28-2009亞運 會食品安全食品過敏原標識標注》均對此有明確的規定。
[0003] 食品過敏原標識管理的有效實施，依賴于完善的技術監控手段。其中，食品過敏原 檢測技術是必不可少的一個組成部分。食品過敏原的檢測技術主要分為兩類，一類是基于 蛋白質的檢測方法，一類是基于基因的檢測方法。到目前為止，國內外都沒有發布過板栗過 敏原成分的標準檢測方法，也尚未建立任何達到行業應用水平的通用方法。該種現狀已經 嚴重影響了板栗過敏原標識管理規定的科學有效實施。
[0004] 基于蛋白質的檢測方法在技術上存在明顯的局限性，并不能完全滿足食品行業生 產管理和監管部口技術監督的需要。基于蛋白質的檢測技術局限性表現為；現有研究結果 表明食品過敏原中能夠引起過敏反應的蛋白質組成復雜，板栗中存在的過敏原蛋白質組成 尚未完全調查清楚，因此W過敏原蛋白質為檢測目標物質建立的蛋白質檢測技術得到的檢 測結果存在與實際致敏效應發生偏差的可能性；基于免疫學原理的蛋白質檢測技術對檢測 樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，與此同時由于預包裝食品種類、配料成分、加工工 藝千差萬別造成背景干擾非常復雜，極大局限了板栗過敏原蛋白質免疫檢測方法的實際應 用效果。此外，相對于核酸而言，板栗過敏原蛋白質容易在食品加工過程中發生變性，對基 于免疫學原理的蛋白質檢測技術造成不可忽略的性能下降。
[0005] 相比之下，基于基因檢測的方法W食品過敏原的特異性基因片段為檢測對象，通 過食品中是否存在過敏原所屬物種的保守基因片段來判斷是否含有某種特定的過敏原成 分。由于核酸的穩定程度比蛋白質高，在食品加工過程中不易被破壞，因此該類技術可W更 加穩定的檢測出微量的過敏原成分。現有常用的基因檢測方法為實時英光PCR法，但是該 方法需要使用大型的儀器設備、耗時長、對技術要求高、成本昂貴，并不適用于基層實驗室 的推廣應用。
[0006] 環介導恒溫基因擴增技術化oop-Mediated Isothermal Amplification, W下簡 稱恒溫擴增法）是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，是一種簡 便、快速、高特異的基因擴增法，不需要昂貴的特殊設備。與實時英光PCR方法相比成本更 為低廉、操作更為簡便，更加適合基層實驗室推廣應用。
[0007] 目前尚未有將LAMP法應用于快速檢測板栗的試劑盒方法。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的在于提供一種板栗過敏原的恒溫擴增檢測方法。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供一種用于檢測板栗過敏原的恒溫擴增試劑盒。
[0010] 本發明的另一個目的在于提供一組用于檢測板栗過敏原的特異性恒溫擴增引物。
[0011] 本發明所采取的技術方案是： 一種板栗過敏原的恒溫擴增檢測方法，包括W下步驟： 1) 根據板栗leafy-like protein mRNA特異性序列設計特異性恒溫擴增檢測引物； 2) 待檢樣品0臟在上述引物、化^ 2.0 Warmstar DNA聚合酶存在的條件下進行恒溫 擴增反應； 3) 根據擴增結果判斷待檢樣品中是否存在板栗過敏原成分。
[0012] 作為優選的，所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 內引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 內引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 環引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 環引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[0013] 步驟2)所述恒溫擴增反應的體系為；25y L反應體系中含有外引物1和外引物2 各2~lOy ]?、內引物1和內引物2各20~60y ]?、環引物1和環引物2各5~20y 2. 0 Warmstar DM 聚合酶 5 ~10 U、p服.8 的 Tris-肥 1 20 mM、KCl 8 ~12 ml、（NH4)2S04 8 ~12 mM、0. 08 ~0. 12% Tween-20、dNTPs 1.5 ~1.7mM、M拆〇4 0. 6 ~l.OmM、甜菜堿 0. 7 ~ 0. 9M，待檢樣品DNA 2y L。
[0014] 作為優選的，步驟2)所述恒溫擴增反應的體系為；25y L反應體系中含有外引物 1和外引物2各5 y M、內引物1和內引物2各40 y M、環引物1和環引物2各20 y M、化f 2. 0 Warmstar DM 聚合酶 8U、抑8. 8 的 Tris-肥 1 20 mM、KCl 10 mM、（NH4)2S〇4lO mM、0. 1〇/〇 Tween-2〇、dNTPs 1. emM、M拆〇4 0. SmM、甜菜堿 0. SM，待檢樣品 DM 2 y L。
[0015] 步驟2)所述恒溫擴增反應的程序為；63~65 °C恒溫反應45~60min。
[0016] 步驟3)可采用曲線法或顯色法判斷擴增結果，曲線法：在反應體系中恒溫加入 1-20 y M SYT0-9使用英光PCR儀或其它恒溫英光檢測儀進行檢測，根據擴增曲線判斷結 果，有"S"型擴增曲線的為陽性，無"S"型擴增曲線的為陰性；顯色法：在反應體系中加入 500-2000XGeneFinder，根據顏色判斷結果，陽性為綠色，陰性為澄色。
[0017] 一種用于檢測板栗過敏原的恒溫擴增試劑盒，其包括6條根據板栗leafy-like protein mRNA序列設計的特異性恒溫擴增檢測引物。
[0018] 所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 內引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 內引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 環引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 環引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[001引 所述試劑盒中還包括W下組分:公別2. 0 Warmstar DM聚合酶、p服.8的 Tris-肥 1、KC1、（NH4)2S04、Tween-20、dNTPs、M拆04、甜菜堿、GeneFinder 或 SYT0-9、陽性對 照和陰性對照，所述陽性對照為板栗標準品或含有leafy-like protein基因序列的重組 質粒，所述陰性對照品為dd&O 一組用于檢測板栗過敏原的特異性恒溫擴增引物，其序列分別如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 內引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 內引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 環引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 環引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[0020] 本發明的有益效果是： 本發明基于環介導等溫擴增技術，根據板栗leafy-like protein mRNA序列設計了 6條特異性引物，能特異性識別祀基因序列上的8個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在祀 標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上周而復始形成有很多環的花挪菜結構的莖一環 〇臟混合物。采用特異性引物及一種具有鏈置換活性的化^ 2.0 WarmStar 0臟聚合酶，在 63~65C對核酸進行擴增反應，反應需在恒溫條件下進行，在45~60min的短時間內擴增 效率可W達到1爐~1〇1°個拷貝數。本方法具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、 鑒定簡便、適合現場檢測等有益效果： (1) 快速高效；整個擴增只用45~60min即可完成，擴增產量可達109~l〇w個拷貝； (2) 操作簡便；不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要 一部檢測儀就能反應和檢測，條件比較溫和； (3) 高特異性；本發明根據過敏原的外源基因與內源基因結合處設計了 6條特異性引 物，應用上述6條引物，擴增祀序列的8個區域，具有很強的品系特異性，且非常穩定，形成 引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行； (4) 高靈敏度；最低檢測極限可達到10個拷貝； (5) 鑒定簡便；加入500-2000XGeneFinder，根據顏色判斷結果，陽性為綠色，陰性為 澄色；在反應體系中恒溫加入1-20 y M SYT0-9使用英光PCR儀(如AB口500)或其它恒溫 英光檢測儀（Genie II )進行檢測，根據擴增曲線判斷結果，適合現場檢測。
【附圖說明】
[0021] 圖1為板栗過敏原特異性恒溫擴增引物篩選圖(其中A為第一套引物的擴增情況， B為第二套引物的擴增情況，C為第H套引物的擴增情況）； 圖2為板栗最佳反應體系實驗圖； 圖3為實施例3靈敏度實驗結果（曲線法）； 圖4為實施例3靈敏度實驗結果(顯色法，其中，1-2為100%陽性樣品，3-4為10%陽性 樣品，5-6為5%陽性樣品，7-8為1%陽性樣品，9-10為0. 5%陽性樣品，11-12為0. 1%陽性 樣品，13-14為0. 05%陽性樣品，15-16為陰性對照）； 圖5為實施例4特異性實驗結果（曲線法）； 圖6為實施例4特異性實驗結果(顯色法，其中，1-2為陽性對照，3-4為陰性對照，5-6 為1號樣品，7-8為2號樣品，9-10為3號樣品，11-12為4號樣品，13-14為5號樣品，15-16 為6號樣品，17-18為7號樣品，19-20為8號樣品，21-22為9號樣品，23-24為10號樣品， 25-26為11號樣品，27-28為12號樣品，29-30為13號樣品，31-32為14號樣品，33-34為 15號樣品，35-36為16號樣品，37-38為17號樣品）； 圖7為實施例5實際樣品檢測結果（曲線法）； 圖8為實施例5實際樣品檢測結果(顯色法，其中，1-2為陽性對照，3-4為陰性對照， 5-6為樣品1，7-8為樣品2,9-10為樣品3,11-12