一種l-氨基酸生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種k氨基酸生產方法。
【背景技術】
[0002] 目前世界上可用發酵法生產的氨基酸有20多種。氨基酸a碳原子分別W共價鍵 連接氨原子、駿基和氨基及側鏈。側鏈不同，氨基酸的性質不同。氨基酸被廣泛應用于食 品、飼料、醫藥工業，包括：強化食品增鮮劑（賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中）；谷氨酸單 軸和天冬氨酸、苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二膚甜味劑（a -天冬醜苯丙氨酸 甲醋）；甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料；多種復合氨基酸制劑可通過輸液治 療營養或代謝失調。
[0003] 氨基酸的生產方法有多種，包括直接發酵法、酶法（利用微生物細胞或微生物產 生的酶來制造氨基酸）、提取法（蛋白質水解，從水解液中提取）等等。傳統的提取法、酶法 和化學合成法由于前體物的成本高，工藝復雜，難W達到工業化生產的目的。隨著載體、受 體系統的構建及體外基因重組技術的日益完善，氨基酸生物工程菌的構建有了進一步的發 展。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種k氨基酸生產方法。
[0005] 在本發明的第一方面，提供一種提高k氨基酸生產菌的k氨基酸產量的方法，所 述方法包括：在心氨基酸生產菌中提高谷氨醜胺酶YbaS的表達或活性；例如，在k氨基酸 生產菌中過表達（外源的）谷氨醜胺酶孔aS ;培養該菌株，從而生產k氨基酸。
[0006] 在一個優選例中，所述的心氨基酸包括（但不限于）賴氨酸色氨酸，心蘇 氨酸。
[0007] 在另一優選例中，所述的谷氨醜胺酶孔aS的氨基酸序列為；（a)GenBank登錄號： NP_415018. 1 ;或其同功能變體，如將（a)多膚經過一個或多個（如1-20個；較佳地1-10 個；較佳地1-4個；更佳地1-3個；更佳地1-2個）氨基酸殘基的取代或添加而形成的，且 與（a)多膚同功能的多膚。
[000引在另一優選例中，所述方法包括：
[0009] (a)提供一種重組質粒，所述重組質粒中包含一重組表達盒，該重組表達盒含有： 谷氨醜胺酶孔aS編碼基因；和
[0010] 化）將（a)的重組質粒轉化心氨基酸生產菌，從而提高谷氨醜胺酶孔aS的表達或 活性；
[0011] (C)培養（b)菌株，從而生產k氨基酸。
[0012] 在另一優選例中，所述的k氨基酸是k賴氨酸，k賴氨酸生產菌是包含pDCtet 質粒和pD化an質粒的大腸桿菌；或
[0013] 所述的k氨基酸是k色氨酸，k色氨酸生產菌是CIBTS2 ;或
[0014] 所述的k氨基酸是心蘇氨酸，k蘇氨酸生產菌是包含（外源的）ppc、aspA、 pntAB、t虹A*基因的大腸桿菌（較佳地為MG1655)。
[0015] 在另一優選例中，所述的心氨基酸生產菌是MG1655。
[0016] 在本發明的另一方面，提供谷氨醜胺酶孔aS的用途，用于提高k氨基酸生產菌的 k氨基酸產量。
[0017] 在一個優選例中，所述的心氨基酸包括（但不限于）賴氨酸色氨酸，心蘇 氨酸。
[0018] 在本發明的另一方面，提供一種重組的k氨基酸生產菌，所述的k氨基酸生產菌 中谷氨醜胺酶孔aS高表達或高活性。
[0019] 在一個優選例中，所述的心氨基酸生產菌的基因組中整合有外源的谷氨醜胺酶 孔aS編碼基因。
[0020] 在本發明的另一方面，提供一種用于生產心氨基酸的試劑盒，所述的試劑盒中包 括所述的重組的k氨基酸生產菌。
[0021] 在一個優選例中，所述的試劑盒中還包括：
[002引 k氨基酸生產菌的培養基；或
[002引表達誘導劑（如IPTG)。
[0024] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[00巧]圖 1、pTrc-ybaS 酶切圖譜。1 ;pTrc-ybaS 利用 EcoRV 酶切，得到約 1. 3化/4. lk:b 片段；M ;marker。
[0026] 圖2、pTrc-y油S質粒圖譜。
[0027] 圖3、pT虹質粒質粒圖譜。
【具體實施方式】
[0028] 本發明人經過深入的研究，首次掲示一種通過在心氨基酸生產菌中增加谷氨醜 胺酶YbaS的表達或活性，提高k氨基酸（如k賴氨酸、k蘇氨酸、k色氨酸）產量的方 法。所述方法可顯著提高心氨基酸的產量。
[0029] 如本文所用，"外源的"或"異源的"是指相對于細胞而言，所述的谷氨醜胺酶YbaS 編碼基因并非來自于其本身，而是通過重組方法構建插入。
[0030] 所述的氨基酸生產菌"是指在適當的培養條件下，可重組表達生產k氨基酸 的菌株，較佳地所述菌株是大腸桿菌。現有技術中已經構建了一些k氨基酸生產菌株，該 些菌株均可應用于本發明中。并且，本領域技術人員均了解常規的k氨基酸如心賴氨酸， k色氨酸，k蘇氨酸生產菌株的構建方法。
[0031] 對于k氨基酸在大腸桿菌中的生產通路，本領域技術人員具有一定水平的了解。 因此，人們知道如何選擇氨基酸生產菌"，例如，在EP1253195、EP1477564中，報道了一 些心氨基酸生產菌的構建。
[0032] 作為本發明的優選方式，所述的k氨基酸生產菌是大腸桿菌，較佳地所述大腸桿 菌中W下的一個或多個基因被弱化或表達降低；a.編碼己醇脫氨酶的a化E基因；b.編碼 己酸激酶的ackA基因；C.編碼磯酸己醜轉移酶的pta基因；d.編碼乳酸脫氨酶的1化A基 因；e.編碼甲酸轉運蛋白的化cA基因；f.編碼丙麗酸甲酸裂解酶的pflB基因；g.編碼丙 麗酸氧化酶的poxB基因；h.編碼天冬氨酸激酶1/高絲氨酸脫氨酶I雙功能酶的t虹A基 因；i.編碼高絲氨酸激酶的t虹B基因；j.編碼賴氨酸脫駿酶的IdcC基因；或h.編碼賴氨 酸脫駿酶的cadA基因。
[0033] 作為本發明的優選方式，所述的心賴氨酸生產菌（大腸桿菌）中選自W下的一個 或多個基因被增強或過表達；a.編碼解除賴氨酸反饋抑制的二氨二化巧合成酶的dapA基 因；b.編碼二氨二化巧二駿酸還原酶的da地基因；C.編碼二氨基庚二酸脫氨酶的cklh基 因；d.編碼四氨化巧二駿酸玻巧醜酶的dapD和編碼玻巧醜二氨基庚二酸脫醜酶的dapE ; e.編碼天冬氨酸-半酵脫氨酶的asd基因；f.編碼磯酸帰醇丙麗酸駿化酶的卵C基因；或 g.編碼煙酸胺腺嘿嶺二核巧酸轉氨酶的pntAB基因。
[0034] 作為本發明的優選實施方式，所述的心賴氨酸生產菌是包含pDCtet質粒和 pD化an質粒的大腸桿菌。當生產心色氨酸時，所述的心色氨酸生產菌是CIBTS2。當生產 k蘇氨酸時，所述的k蘇氨酸生產菌是包含外源的PPc、aspA、pntAB、t虹A*基因（編碼SEQ 10^:24的多膚）的大腸桿菌（較佳地為161655)。卵(3、3394、911148、1虹4*(1虹4定點突 變G433R)等基因均是本領域公知的基因。
[00巧]NCBI已公開了"谷氨醜胺酶孔aS"的序列，例如其序列可參見GenBank登錄號 NP_415018. 1 所示。
[0036] 本發明的"谷氨醜胺酶孔aS的編碼基因"的核巧酸全長序列或其片段通常可W用 PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關 核巧酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員 已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
[0037] 為