5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的環式重排變體和互補片段對的制作方法
【專利說明】5-婦醇式丙鋼醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環式重排變體和 互補片段對 發明領域
[0001] 本發明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環式重排變體和互補片段 對，及生成和使用它們的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶（EPSPS)是真菌、細菌、藻類、高等植物及 寄生于脊椎動物上的寄生蟲頂覆蟲體內芳香族氨基酸合成途徑（即莽草酸合成途徑）中一 個關鍵酶，它催化一分子的莽草酸-3-磯酸（S3P)和磯酸帰醇式丙麗酸（陽P)生成5-帰醇 式丙麗酸莽草酸-3-磯酸（EPSP)。莽草酸合成途徑產物除參與芳香族氨基酸如苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸等的合成W外，還參與植物體內一些生物堿、香豆素、類黃麗、木質素、剛巧 衍生物、酷類物質等的次生代謝，形成的植物組分占植物干重的大約35%甚至更多。
[0004] 草甘麟，即N-麟醜甲基甘氨酸，是一種廣譜、高效的發芽后除草劑。草巧麟一經施 用后能被植物迅速吸收，并隨其同化產物傳導至整個植株，阻斷EPSP的合成和運輸，它是 EPSPS合成底物PEP的競爭性抑制劑，可阻斷陽P和S3P該兩種底物在EPSPS的催化下向 EPSP的轉化，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，因此對植物細胞分裂、葉綠素合成、蒸騰、 呼吸W及蛋白質等代謝過程產生影響而導致植物死亡。
[0005] 環式重排（circular permutation, CP)是一種重要的蛋白質定向進化分析的手 段。蛋白質的環式重排是將蛋白質的一級序列進行重排，比如說在將一個特定位點的N端 移動到該個特定位點C端的C端，即使得原來該點的C端成為了新的蛋白質變異體的N端， 該點的原來的N端成為新蛋白變異體的C端。一般來說新的N端和C端之間要加一個柔初 性較好的接頭，促進新蛋白質的折疊。簡單來說相當于用一個接頭將蛋白質原來的N端和 C端相連，然后在蛋白質的內部某一個位點"剪開"，產生新的N端和C端巧日圖1所示)。
[0006] 在自然界中已經發現了一些蛋白質環式重排變異體，產生機制一般有兩種類型， 分別是復制/刪除機制W及分裂融合機制。對于前者來說，一個基因發生了水平串聯復制， 然后在N端和C端發生了任意剪切，造成了環式重排變異體的形成。對于后者來說，一個已 有的蛋白的分裂產生了兩個蛋白結構域或者蛋白質的片段，它們直接的重新融合產生了新 的環式重排變異體。該些新的蛋白質重排變異體大多數依舊可W折疊成與天然蛋白質類似 的H維結構，所W依舊擁有與天然蛋白質類似的功能。當然該些變異體一般情況下活力不 如原來的母體，個別可能擁有更高的活力，但是該些變異體經常會擁有一些特殊功能，比女口 說對蛋白酶裂解的敏感性降低、識別更廣譜的底物或者配體、更高的熱穩定性，所W近年來 環式重排作為一種改造蛋白質特性的手段得到了研究人員越來越多的關注。
[0007] 蛋白質片段互補，1957年化chards發現，用蛋白酶裂解核糖核酸酶A后得到兩個 只有很少酶活性的膚鏈一S蛋白和S膚鏈，將兩者混合在一起可W恢復其核糖核酸酶的活 性，該被稱之為蛋白重建（protein reconst;Uution)。后來，人們又發現許多蛋白可W由其 兩個或兩個W上的片斷成功重建，該些片斷既可W由蛋白酶消化產生，也可W通過基因表 達的方法生成，例如葡萄球菌的核酸酶、色氨酸抑制子等。該些可W拆分的蛋白無論大小都 可能包含一個W上的能成功使蛋白重建的分拆位點，如氨醜tRNA合成酶有939個氨基酸， 含有至少八個該樣的分拆位點。
[0008] 用于蛋白重建的片段通常包括整個結構單元或者超二級結構域。蛋白能夠重建表 明該蛋白至少可W在兩個二級結構之間的片段區域中的共價鍵斷開后仍舊保持一定的片 段穩定性，而蛋白內的非共價作用則十分特殊，從而使片段有利于向天然的結構靠塊，卻不 形成其它的異變結構。在生物進化過程中，該類蛋白中使其形成天然結構的非共價作用被 極大的優化，從而利于形成天然的結構元件或亞結構域。因此無論是一個完整的膚鏈還是 兩條膚鏈，兩個沒有共價鍵相連的亞結構域可W自發的形成天然的蛋白結構。
[0009] 蛋白質的片段互補已經被用作研究結構域排列的工具，也被用作研究早期折疊中 間態的模型。結合定點突變的蛋白重建可W用來評價單個氨基酸側鏈對蛋白穩定性的影 響，結合瞻菌體展示可W確定兩個片段之間起主要相互作用的位點。重建的蛋白并非一旦 結合就永不分開，其片段在形成復合體和解離成單獨的片段之間形成動態平衡，該種平衡 的偏移方向取決于片段之間作用力的強弱。
[0010] 最新的研究表明，大腸桿菌的EPSPS也可W由片段天然互補重建其酶活性。把其 基因在218/219氨基酸位點分拆為兩段后，編碼出的兩個片段在aroA缺陷的大腸桿菌菌株 體內可W互補其EPSPS活性；將該兩個片段分別表達，其單體大多W包含體形式存在，把純 化的包含體共復性，就可W互補重建EPSPS活性。說明大腸桿菌的EPSPS無論在體內還是 體外，均能通過片段互補重建其活性。
[0011] 片段互補可W有效的解決抗草甘麟EPSPS轉基因植物擴散的問題，比如將EPSPS 的N端編碼基因加上葉綠體定位膚編碼基因在植物細胞核染色體中表達，而將C端編碼基 因在葉綠體中表達。單獨一個基因表達產生的片段都不具有EPSPS的活性，因此即使擴散 到了外界環境，也沒有選擇優勢。而當N端片段表達出后，在定位膚的作用下被運輸到葉綠 體，和C端片段互補重組EPSPS活性。如果片段互補的EPSPS突變后具有較高的草巧麟耐 受性，把其分別轉入植物的染色體基因組和葉綠體基因組，植物就可W獲得草巧麟耐受性。
[0012] 但是問題在于，許多結構剛性比較強的蛋白很難找到能夠直接發生天然互補的位 點，或者說即使可W發生天然互補，效率也比較差。一個潛在的解決方案在于將兩個片段分 別與可W發生相互作用的兩個蛋白質或者可W發生二聚化的結構域融合，通過蛋白質的相 互作用或者結構域二聚化使得兩個天然無法互補的片段在空間上接近，提高它們相互作用 時的濃度，該樣就很有可能將幫助兩個片段進行互補。但是同樣的基于該種方法的位點也 不是隨機選取的，而且前人的研究成功的實例或多或少都帶有一定的經驗成分，所W建立 一種確定該位點的有效方法很重要。我們實驗中建立了將環式重排的位點作為輔助獲得蛋 白質片段互補的位點的體系。因為環式重排本質上是利用的短的接頭，將蛋白質兩個片段 直接連在一起，使其在空間上靠近，折疊成天然的活性蛋白質。而蛋白質相互作用輔助的片 段互補技術是通過蛋白質的相互作用將兩個不能天然互補的片段在空間上拉近，使其恢復 天然蛋白質的活力，因此兩者之間有內在的聯系，我們認為環式重排的研究是很好的蛋白 質片段互補系統研究的基礎。
[001引發明概述
[0014] 一方面，本發明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環式重排變異體， 其從N端到C端W B-L-A表示，其中L代表接頭，A代表5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸 合酶全長氨基酸序列N端至第P位的氨基酸區段，B代表5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯 酸合酶全長氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸區段。在一個實施方案中，其中所述5-帰 醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶為大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶。 在進一步的實施方案中，所述大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所 示。在進一步的實施方案中，P 選自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、 300、328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在進一步的實施方案中，口選自110、145、 215、229、300、328和362。在另一個實施方案中，在所述5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯 酸合酶不是序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情況下，P為 與序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、 160、185、215、229、234、240、268、300、328、：342、358、359、360、361、362、363 或 364 位對應 的位置。在進一步的實施方案中，P為與序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草 酸-3-磯酸合酶第110、145、215、229、300、328或362位對應的位置。在一個實施方案中， L 為（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 接頭。
[0015] 另一方面，本發明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的互補片段對，其 中第一片段從N端到C端W E-L1-A表示，第二片段從N端到C端W F-L2-B表示，其中E 和F代表相同或不同的二聚化膚，L1和L2代表相同或不同的接頭，A代表5-帰醇式丙麗 醜-莽草酸-3-磯酸合酶全長氨基酸序列N端至第P位的氨基酸區段，B代表5-帰醇式丙 麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶全長氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸區段，其中當E和F相 同時發生同二聚化，或者當E和F不同時發生異二聚化。在一個實施方案中，所述5-帰醇 式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶為大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶。在 進一步的實施方案中，所述大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所示。 在進一步的實施方案中，P 選自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、 328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在進一步的實施方案中，口選自110、145、215、 229、300、328和362。在另一個實施方案中，在所述5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合 酶不是序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情況下，P為與序列 1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、160、185、 215、229、2：34、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363 或 364 位對應的位置