一個簇毛麥乙烯反應元件結合蛋白基因的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，公開了一個簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因的應 用。
【背景技術】：
[0002] 小麥是世界上分布最廣、種植面積最大的糧食作物，對人類糧食安全具有舉足輕 重的作用。禾布氏白粉菌小麥專化型炬lumeria gramimis f.sp.tritici Marchal，異 名為&rysiphe graminis DC. f. sp. tritici Marchal,縮寫為 Bgt)是侵染小麥的專性 活體寄生真菌，它的寄生范圍還包括黑麥、燕麥W及其他小麥近緣植物如老芒麥巧lymus sibiri州S)、冰草（Agropyron cristatum)、圓柱披堿草巧lymus c}din化i州S)和偃麥 草巧lytrigia r巧ens)等（參考文獻；盛寶欽；段霞瑜；向齊君；周益林.我國北方11省 (區）、直轄市小麥白粉病菌寄主范圍研究.中國農業科學，1995,6:52-57)。多年W來，該 病在全世界范圍內普遍發生并危害嚴重。
[000引簇毛麥Olaynaldia villosa，化=14, W)，是小麥的一個野生近緣種，它高抗小 麥白粉病、誘病、梭條花葉病、全蝕病等病害，并具有抗旱、耐鹽、耐寒等特性，是小麥抗逆 遺傳改良的寶貴基因資源庫。其中來自簇毛麥6VS的化21基因是目前抗白粉病主效基 因之一，具有抗性強、抗譜廣等特點，是目前為止最有效的抗白粉病基因（參考文獻；化en P D, Qi L L, Zhou B, et al. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdeiy mildew. Tlieor Appl Genet, 1995, 91:1125-1128.)。
[0004] 利用基因巧片篩選差異表達的基因，是后基因組時代進行高通量基因篩選與克隆 的有效方法之一。為了研究化21基因對白粉病的抗性機理，本實驗室利用接種白粉菌后的 抗、感簇毛麥和非接種的抗病簇毛麥的cDNA，分別與大麥基因巧片上的探針雜交（參考文 獻；曹愛忠，李巧，陳雅平，鄒曉文，王秀娥，陳佩度.利用大麥基因巧片篩選簇毛麥抗白粉 病相關基因及其抗病機制的初步研究.作物學報，2006, 32(10) : 1444-1452)。通過比較接 種白粉菌前后抗病簇毛麥的表達譜，篩選出上調表達的基因，包括病程相關蛋白、防衛反應 基因、轉錄因子、信號傳導因子和抗病基因類似物等。根據W上基因巧片雜交結果，利用上 調表達探針序列設計引物，從接種白粉菌后抗病簇毛麥的cDNA中克隆獲得基因片段，對該 些片段進行序列比對，選擇與抗病性相關的序列，篩選抗病簇毛麥cDNA文庫，獲得了一個 己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的全長，利用基因槍技術將其轉化感白粉病小麥品種 揚麥158中，W期提高其抗逆性。
【發明內容】
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[0005] 本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種簇毛麥己締反應元件結合蛋 白基因HvEREBP。
[0006] 本發明的另一目的是提供該基因的表達載體。
[0007] 本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。
[000引本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0009] 己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP，來自簇毛麥，其核巧酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0010] 該簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因編碼的蛋白質HvEREBP，其氨基酸序列的 GenBank 獲得 accession number 為 FJ711058。
[0011] 含有所述的簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的表達載體。
[0012] 含有所述的簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的表達載體優選W PAHC25為出發載體，將所述的HvEREBP基因插入PAHC25的Smal和SacI酶切位點間所得。
[0013] 所述的簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP在培育耐鹽和/或赤霉病小麥 品種中的應用。
[0014] 所述的簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的表達載體在培育耐鹽和/或 赤霉病小麥品種中的應用。
[00巧]有益效果；
[0016] 本發明從簇毛麥中克隆得到了一個己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP及其所 編碼的蛋白質HvEREBP。HvEREBP可用于基因工程育種，將其插入表達載體PAHC25,得到該 基因的過量表達載體導入赤霉病感病小麥品種中，可W提高感病小麥品種對霉病的抗性。 同時，轉入本發明己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的轉基因植株能夠顯著提高植株的 耐鹽性。
【附圖說明】
[0017] 圖IHvEREBP過量表達載體構建
[0018] 圖2HVEREBP基因轉化揚麥158的T。代陽性轉基因植株PCR分子鑒定結果
[0019] M: DL2000，1泳道為揚158對照，2泳道為水對照，24泳道為質粒對照，3-28泳道為 不同的轉基因植株。箭頭所示為擴增出的目標基因片段。
[0020] 圖3轉Hv-EREBP基因小麥苗期耐鹽性生長指標；苗長（A)、根長炬）、苗鮮重似、 苗干重值）、根鮮重巧）、根干重（巧分析。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1簇毛麥己締反應元件結合蛋白基因HvEREBP的克隆
[002引本實驗室前期利用簇毛麥受白粉菌誘導后的cDNA樣品與大麥表達譜巧片Barley IGeneChip(http://www. affymetrix. com/products/arrays/specific/barley. affx) 雜交，通過比較接種白粉菌前后抗病簇毛麥的表達譜，篩選出上調表達的基因，包括病程相 關蛋白、防衛反應基因、轉錄因子、信號傳導因子和抗病基因類似物等。根據巧片雜交結果， 選擇上調表達、根據抗病相關基因設計的探針Contig3867,經NCBI注釋為一個EREBP轉 錄因子基因，用 PrimerS (http://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3www. 班i)設計簡并引物，利用篩選簇毛麥葉片cDNA文庫的方法克隆獲得了該基因的全長序列。 [002引本發明所用的白粉菌誘導12h的簇毛麥葉片cDNA文庫（陳雅萍，2005)，能夠滿足 對簇毛麥葉片中化21基因和其它抗性基因、防衛基因和其它優良基因的克隆研究。cDNA 片段兩端經Not I和Sal I酶切位點定向克隆于pSPORTl載體。pSPORTl載體能被Immol/ L IPTG(isopropylthi0-|3-galactoside)誘導，通過半乳糖巧啟動子表達被克隆的基因。 多克隆位點的設計便于用Henikoff法進行套式缺失的構建和測序，其它特征和PUC系列 載體類似。為長期保存文庫和減小篩庫工作量，先從5個384孔板每4-5個小混合池中各 吸1 y 1菌液，將其混合到一起，37°C擴大培養后提取質粒。每塊384孔板提取80個質粒， 共有 400 個質粒。首先用 Contig3867 引物 P1(CTCTCCCAAGATGACTTCAG(SEQ ID NO. 2))和 P2(CATAAGAAACCTCGTCCAAG(SEQ ID NO. 3)) W上述的400個混合池質粒DM為模板進行 PCR擴增，篩選到一個陽性的混合質粒；然后取1