甘蔗分蘗關鍵基因ScD27基因序列的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學中的基因技術領域，屬于植物基因工程技術領域，具體設 及一個調控甘庶分葉關鍵基因0 -胡蘿h素異構酶基因SCD27的序列。
【背景技術】
[0002] 甘庶的分葉是決定其產量的最重要的農藝性狀之一，甘庶作為世界上最重要的糖 料作物，研究甘庶分葉具有重要的實踐與理論意義。植物激素是植物生長和發育的重要調 控因子，植物獨腳金內醋（Strigolactones.，化S)是一種在根部產生的類胡蘿h素衍生 物，是最近才被發現的一種抑制植物分枝和分葉的新激素，參與植物發育的調節。研究表 明，在植物營養受到限制時，獨腳金內醋會在植物的根部生成并促進側根和根毛的生長，同 時獨腳金內醋被運輸至植物的出芽位置，抑制側芽或刺激分枝的生長，從而增加植物根部 對無機營養物質的捕獲，減少分葉對資源的需求。然而SLs的合成和信號傳導途徑目前還 是不完全清楚，其信號途徑更是知之甚少，在甘庶中還未見相關報道。
[0003] 對多分葉水稻突變體的研究發現，在單子葉和雙子葉植物中獨腳金內醋調控分枝 的機制具有共同的合成和信號傳導途徑MAX/RMS/D路徑，其中D17、D10、D27分別編碼類胡 蘿h素裂解雙加氧酶CDD7XCD8 W及含鐵蛋白D27,它們均定位于細胞質體中，主要參與化 的合成，且相應的突變體對化類似物GR24敏感。因此，D27在植物的獨腳金內醋合成中起 重要作用，是研究植物分葉和株型調控的重要基因，但是ScD27基因的功能仍不十分清楚， 在甘庶中Sc D27基因還未見相關報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一個甘庶分葉關鍵基因及基編碼 的蛋白，所提供調控甘庶分葉關鍵基因0-胡蘿h素異構酶基因SCD27的序列，是通過W近 源物0-胡蘿h素異構酶基因的CDS序列的保守區設計簡并引物，并用PCR法擴增，結合 RACE技術克隆甘庶0-胡蘿h素異構酶基因ScD27的全長序列。其核巧酸如序列表中SEQ ID NO. 2所述，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所述。
[0005] 本發明的目的是通過W下技術措施實現：
[0006] 0 -胡蘿h素異構酶，所述0 -胡蘿h素異構酶為由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列 編碼的蛋白。
[0007] 編碼權利要求1所述的0 -胡蘿h素異構酶的核巧酸序列。
[0008] W上核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 甘庶分葉關鍵基因ScD27基因序列，所述ScD27基因為編碼0-胡蘿h素異構酶 基因。
[0010] 所述甘庶0 -胡蘿h素異構酶基因編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
[0011] 所述甘庶0 -胡蘿h素異構酶基因核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[001引 1.利用同源克隆的方法，PCR擴增甘庶中的ScD27目的片段。
[0013] ①總RNA的提取
[0014] W甘庶品種ROC22為材料，取新鮮甘庶莖尖生長點，使用Trizol試劑，按照使用說 明提取甘庶總RNA。
[00巧]②cDNA第一鏈的合成
[0016] 甘庶總RNA作為模板，利用天根反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。
[0017] ⑨引物設計依據，引物合成的方法
[001引從GenBank中下載近源物種（高梁、玉米、水稻等）0-胡蘿h素異構酶基因CDS 序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計引物，擴增片 段大小約為48化P。引物設計后交給上海生物工程公司合成。
[0019] 引物序列為；s-d27-431F ;CTGGGATGAAGAACGGAAA SEQ ID NO. 3
[0020] s-d27-886R ;TGATCCAGCACTGAAGCAGC 沈Q ID NO. 4
[0021] 擴增的產物用1. 2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，從凝膠中純化回收48化p目標產物， 將純化的PCR產物克隆到PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌D冊a感受態細胞中，挑取陽性克 隆，提取質粒DNA。W s-d27-431F和s-d27-886R引物PC R檢測，有約480bp大小目的條帶 的單克隆送上海生物工程生物公司進行雙向測序。
[002引 2. ScD27基因cDNA全長序列的克隆
[002引 3'RACE 和 5' RACE 均使用 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒完成， 均按其說明書進行操作。根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物，擴增目的基因的3' 和5'末端。方法如下；
[0024] W甘庶莖尖總RNA為模板，利用SMART? RACE試劑盒中自帶的反轉錄接頭引物及 試劑，反轉錄合成帶有接頭的cDNA第一鏈。
[0025] 在3' RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反應的特異性，首先利用3' RACE外 側特異引物和試劑盒中提供的外側接頭引物UPM進行第一次PCR反應，所得的產物稀釋5 倍后作為第二次PCR反應的模板，3' RACE內側特異引物和試劑盒中提供的內側接頭引物 NUP進行第二次巢式的PCR反應。
[0026] 3' RACE 外側特異引物；5' -GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT-3'（SEQ ID NO. 5)
[0027] 3' RACE 內側特異引物；5' -GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG-3'（SEQ ID NO. 6)
[0028] 在5' RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反應的特異性，首先利用5' RACE外 側特異引物和試劑盒中提供的外側接頭引物UPM進行第一次PCR反應，所得的產物稀釋5 倍后作為第二次PCR反應的模板，5' RACE內側特異引物和試劑盒中提供的內側接頭引物 NUP進行第二次巢式的PCR反應。
[0029] 5, RACE 外側特異引物；5, -CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA-3'（SEQ ID NO. 7)
[0030] 5' RACE 內側特異引物；5' -CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG-3'（SEQ ID NO. 8)
[0031] 擴增的產物用1. 2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，從凝膠中純化回收48化p目標產物， 將純化的PCR產物克隆到PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌D冊a感受態細胞中，挑取陽性克 隆，提取質粒DNA。W PMD-18T載體的自帶引物PCR檢測，有48化P大小目的條帶的單克隆 送上海生物工程生物公司進行雙向測序。利用DNA man 6.0對測序結果與保守區序列設計 引物擴增所得序列進行拼接。
[003引 3.對0 -胡蘿h素異構酶基因ScD27的巧。定
[0033] 將拼接結果用BLAST在線軟件進行同源性測定，已確定為甘庶e -胡蘿h素異構 酶基因ScD27同源序列。比對結果如圖1所示。
[0034] 將拼接結果用ORF閱讀框在線分析軟件進行蛋白質同源性測定，也確定其為甘庶 0 -胡蘿h素異構酶基因ScD27同源序列。比對結果如圖2所示。
[0035] 本發明與現有技術相比，其有益效果為：
[0036] 甘庶是一種重要的糖料作物，同時也是我國南方沿海地區和邊疆民族地區的重要 農業支柱產業之一，從基因工程和分子水平上研究其產量相關農藝性狀，培育高產甘庶新 品種，提高甘庶產量具有重大的現實意義。通過分離與克隆甘庶0-胡蘿h素異構酶基因 ScD27,我們發現其基因序列與同源植物的相似度最高只有65%，但是其編碼的蛋白序列與 同源作物的相似度則高達98%，該對于在不同植物和甘庶近源屬之間研究其遺傳進化規律 具有重要的意義。同時0-胡蘿h素異構酶基因ScD27是獨腳金內醋合成的上游調控基 因，是影響甘庶分葉形成的重要調控因子，因此該基因的獲得，不僅有利于揭示甘庶中獨腳 金內醋合成的機制，還可W為提高作物的產量和改變甘庶株型提供重要參考。
【附圖說明】
[0037] 圖1為ScD27基因序列比對結果；
[003引圖2為ScD27蛋白序列比對結果。
【具體實施方式】
[0039] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0040] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過購買獲得的 常規產品。
[0041] 1.利用同源克隆的方法，PCR擴增甘庶中的ScD27目的片段。
[0042] ①總RNA的提取
[0043] W甘庶品種ROC22為材料，剝開甘庶頂端葉銷和幼葉，W手術刀剝取新鮮甘庶莖 尖生長點約0.1 g，在液氮中研磨成粉末，使用Trizol試劑，按照使用說明提取甘庶總RNA。
[0044] ②cDNA第一鏈的合成
[0045] W甘庶總RNA作為模板，按天根反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA第一鏈。取 甘庶總RNA 5 y g與反轉錄引物1 y L混合，70°C溫育5min后，立即放置冰上，然后加入 5XBuffer，2. 5mmol/L dNTP 混合液，RNA 酶 Inhibitor 1. 0 y L，M-MLV 反轉錄酶 1. 0 y L，反 應體系加水補足10 uL。
[0046] ⑨引物設計依據，引物合成的方法
[0047] 從GenBank中下載近源物種（高梁、玉米、水稻等）0 -胡蘿h素異構酶基因CDS 序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計引物，擴增片 段大小約為48化P。引物設計后交給上海生物工程公司合成。
[0048] 引物序列為；s-d27_43lF ;CTGGGATGAAGAACGGAAA
[0049] s-d27-886R ；TGATCCAGCACTGAAGCAGC
[0化0] 擴增的產物用1. 2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，從凝膠中純化回收48