一種來源于尖孢鐮刀菌的新(r)-轉氨酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物催化領域，主要涉及一種來源于尖抱鑲刀菌的新（時-轉氨酶及 其在生產手性胺和非天然氨基酸方面的應用。
【背景技術】
[0002] 手性胺和非天然氨基酸在醫藥、食品、化妝品等高附加值領域具有廣泛的應用。例 如（時-4-苯下基-2-胺（抗高血壓藥Dilevalol的前體）、苯基異絲氨酸（目-氨基酸，抗 癌藥紫杉醇的側鏈部分）和Cispentacin (環狀目-氨基酸，抗真菌藥物）等皆為藥物合成 的關鍵中間體或者關鍵手性模塊，D-丙氨酸等非天然氨基酸越來越多被用于高級化妝品。 另外，研究表明，含有非天然氨基酸的多膚應對蛋白酶降解的穩定性高于天然多膚，并且仍 然保持其生物活性。該顯示在研發高穩定性且不被人體排斥的新藥、抗體W及人造蛋白質 方面，非天然氨基酸或將發揮不可替代的作用。然而，與天然氨基酸不同，手性胺和非天然 氨基酸尚不能通過發酵法進行工業化生產，現在主要依靠有機合成法進行生產。有機合成 法的不足是不易得到光學純的產物，而且通常需要高壓高溫高能耗，因此亟需實現手性胺 和非天然氨基酸的綠色生產。
[0003] 轉氨酶，又叫氨基轉移酶，是催化氨基化合物和撰基化合物之間氨基可逆轉移 (兵兵機制）的一類酶，根據其底物氨基的位置，可W分成a-轉氨酶和轉氨酶。a-轉 氨酶較為常見，只能催化a-氨基的轉移；而轉氨酶則較為罕見，除了能催化a-氨基 的轉移，也能催化非a位氨基的轉移，具有更為寬廣的底物譜和嚴格的立體選擇性，能夠 在溫和條件下拆分胺消旋體（附圖la)或者催化前手性底物撰基上的不對稱加氨（附圖 lb)來生產手性胺及非天然氨基酸。另外，轉氨酶W磯酸化唆酵（PL巧為輔基，催化反應 過程中無需添加額外的輔因子循環，該在工業應用中很有優勢。總之，用轉氨酶來生產 光學純的手性胺和非天然氨基酸，可W避免傳統化學法的高壓高溫高能耗高污染，是符合 綠色生產理念的先進生物制造，顯示出替代有機合成法的巨大潛力。例如，2010年Science 報道了 Codexis公司與Merck公司的研究成果，采用（時選擇性的轉氨酶成功替代了 基于貴金屬錯催化的化學法來工業化生產抗糖尿病藥物西他列汀（一種手性胺）。
[0004] 嚴格的立體選擇性是酶區別于化學催化劑的關鍵特性，所W獲得特定立體選擇 性的酶，是后續研究改造和工業應用的重要基礎。根據文獻報道，《-轉氨酶中（巧選擇 性的酶較為常見，而（時選擇性的轉氨酶（下文稱為（時-轉氨酶）卻較為稀有（[1] Koszelewski D，Tauber K，Faber K，et al. co-Transaminases for the synthesis of non-racemic a -chiral primary amines[J]. Trends in biotechnology，2010,28 (6)： 324-332. [2]Mathew S，Yun 吐 CO-Transaminases for the production of optically pure amines and unnatural amino acids [J]. Acs Catalysis, 2012,2(6) :993-10〇]_)。至今為 止，國內尚未有（R)-轉氨酶的報道。因此，發掘具有工業應用潛力的新（R)-轉氨酶對手性 胺和非天然氨基酸的綠色生產具有特殊的意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為手性胺和非天然氨基酸的綠色生產提供一種具有工業應用潛 力的（時-轉氨酶。
[0006] 本發明目的是通過如下技術方案實現的：
[0007] -種來源于尖抱鑲刀菌化sarium 0巧sporum化5176的新佩-轉氨酶（稱為 HF0)，其基因核巧酸序列如SEQ NO. 1所示，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
[0008] 本領域研究者對新（時-轉氨酶HF0進行蛋白質工程改造（例如氨基酸殘基保守 置換、氨基酸序列增長截短、合理設計、定向進化、酶的化學修飾等）所獲得的（時-轉氨酶， 也屬于本發明的范圍。
[0009] 本發明的另一目的是提供一種制備新（時-轉氨酶HF0的方法。
[0010] 該制備方法包括W下步驟；（1)通過PCR技術獲得編碼新（時-轉氨酶HF0的基因 片段。（2)將基因片段構建到祀T28a表達載體上，獲得帶有目的酶基因的重組質粒。（3)將 重組質粒轉入宿主菌細胞（優選大腸桿菌化21 0E3))，獲得相應的工程菌株。（4)將工程 菌株接種至LB培養基中，培養至對數期并用0.1 mM的IPTG于25C誘導表達12小時。（5) 離也收集菌體，破菌留取上清液，采用金屬親和層析法（媒柱）純化回收目的蛋白，并透析 除去咪哇即得HF0純酶液。SDS-PAGE電泳圖譜顯示目的蛋白新（時-轉氨酶HF0大部分可 溶表達，純化所得蛋白條帶單一，達到了電泳純（見附圖2)。
[0011] 本發明的再一目的是提供新（時-轉氨酶HF0的酶學性質、底物譜及應用。
[0012] 本發明的新（時-轉氨酶HF0在弱堿性條件下活力較高，其最適反應抑值為8. 0。 新（時-轉氨酶HTO的最適反應溫度為35C，其在45C的磯酸鹽緩沖液（100mM，pH=7.4)中 賠育20分鐘后，仍保持90% W上的活力。
[0013] 本發明的新（時-轉氨酶HF0具有寬廣的氨基供體底物譜，尤其對各種（時構型伯 胺的活力很高，例如（時-1-苯己胺、（時-2-己胺和（時-2-庚胺，而對（巧構型伯胺的活力 很低，表現出嚴格的（時立體選擇性。該顯示新（時-轉氨酶HF0可用于伯胺消旋體的動力 學拆分。
[0014] 進一步地，本發明的新（時-轉氨酶HF0能夠動力學拆分50mM的1-苯己胺、1-苯 丙胺、1-氨基巧滿和1-(4-氣苯基）己胺，轉化率皆在50%左右，產物的ee值皆>99%，獲 得了光學純的（S)-1-苯己胺（附圖3)、（巧-1-苯丙胺（附圖4)、（巧-氨基巧滿（附圖5) 和（S)-(4-氣苯基）己胺（附圖6)。該些結果，充分顯示了本發明的新（時-轉氨酶W0在 動力學拆分胺消旋體獲得手性胺方面的應用潛力。
[001引本發明的新（時-轉氨酶HF0具有寬廣的氨基受體底物譜，包括麗、羥基麗、a -麗 酸及目-麗酸醋等，并且其對應產物的ee值大都超過99%。該顯示新（時-轉氨酶HF0可 應用于手性胺和非天然氨基酸的不對稱合成。
[001引進一步地，本發明的新佩-轉氨酶HF0能夠將50mM丙麗酸不對稱加氨合成 D-a-丙氨酸，轉化率達到99%，ee值>99% (附圖7);能夠將20mM和50mM的2-麗了酸 不對稱加氨合成D-a-氨基了酸，轉化率分別達到99%和92%，ee值皆>99% (附圖8); 能夠將lOmM的2-麗戊酸不對稱加氨合成D- a -氨基戊酸，轉化率達到85 %，ee值>99 % (附圖9)。該些結果，充分顯示了本發明的新（時-轉氨酶HF0在光學純非天然氨基酸的不 對稱合成方面富有應用潛力。
[0017] 本發明的優點在于；(R)-轉氨酶是比（S)-轉氨酶更稀有的一類轉氨酶，在手 性胺和非天然氨基酸的生物制造中具有特殊意義。本發明公布的新（時-轉氨酶HF0具有 嚴格的（時立體選擇性，并且具有寬廣的底物譜，在手性胺和非天然氨基酸的綠色生產中 顯示出工業應用前景。
【附圖說明】
[0018] 附圖1為W-轉氨酶催化反應示意圖。
[0019] 附圖2為新（時-轉氨酶HF0的SDS-PAGE圖譜。1 ;蛋白質分子量標記，2 ;媒柱純 化所得HF0, 3 ;誘導表達后破菌上清液，4 ;誘導表達后破菌沉淀。
[0020] 附圖3為HF0動力學拆分1-苯己胺的產物光學純度檢測圖譜。
[0021] 附圖4為HF0動力學拆分1-苯丙胺的產物光學純度檢測圖譜。
[0022] 附圖5為HF0動力學拆分1-氨基巧滿的產物光學純度檢測圖譜。
[0023] 附圖6為W0動力學拆分1-(4-氣苯基）己胺的產物光學純度檢測圖譜。
[0024] 附圖7為HF0催化丙麗酸不對稱加氨的產物光學純度檢測圖譜。
[00巧]附圖8為W0催化2-下麗酸不對稱加氨的產物光學純度檢測圖譜。
[0026] 附圖9為HF0催化2-戊麗酸不對稱加氨的產物光學純度檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0027] 下面的實施例進一步說明本發明的部分內容，W便于本領域的技術人員進一步理 解本發明，但不應理解為對本發明的限制。
[0028] 實施例一新（時-轉氨酶HF0的制備方法
[0029] (1)構建工程菌；新（時-轉氨酶HTO的編碼基因（SEQ NO. 1)通過PCR技術從尖 抱鑲刀菌化sarium 0巧sporum化5176基因組DNA中擴增獲得（N端添加有6X化s-tag W 便用媒親和柱純化目的蛋白HF0)，上游引物為:cat此CATGGCTCACCATCATCATCATCACATGGCA ACTATGGACGAGG，下游引物為 cccAAGCTTCTACTAGTAATCAATCTTGAAGCTGAACTC,所獲 PCR 片段 經雙酶切后在化0 I / Hind III位點插入祀T28a表達載體。重組質粒被轉入宿主菌細胞 (優選大腸桿菌化21 0E3))，獲得相應的工程菌株。
[0030] (2)表達純化；采用LB培養基，于37C搖床培養至對數期，降溫至25C后，加入終 濃度為0. 1mm的IPTG，于25C搖床中誘導表達12小時。4°C，600化pm條件下離也收集菌 體，用含有20 uM磯酸化唆酵（PLP)的磯酸軸緩沖液巧OmM，抑7.0)清洗兩遍，并用高壓勻 漿機破碎，13000rpm離也留取上清液，然后采用金屬親和層析（媒柱）法純化回收目的蛋 白，目的蛋白經透析除去咪哇后即得新佩-轉