一種臍血間充質干細胞的分離及培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種廝血間充質干細胞的分離及培養方法。
【背景技術】
[0002] 干細胞是具有一定自我更新能力，并在適宜微環境下具有多向分化潛能的原始 細胞，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌膊、神經、肝、也肌等多種組織細胞。間充質干細胞 (mesenchymal stem cells, MSC)來源于中胚層的非終末分化細胞，它既有間質細胞，又有 內皮細胞及上皮細胞的特征，是細胞治療和組織工程種子細胞的重要來源。間充質干細胞 除來源于骨髓、外周血、脂肪、廝帶外，人廝血也是間充質干細胞的重要來源。廝血間充質干 細胞除上述的分化能力外，甚至具有一定的跨系和跨胚層分化的能力，此外還可支持和促 進造血細胞生長，對造血系統重建有非常重要的作用。
[0003] 廝血是廝帶及胎盤近胎兒一側血管內的血液，含有豐富的干細胞和祖細胞，其主 要包含造血干細胞和間充質干細胞。廝血來源充足，采集方便，免疫原性較弱，能更大程度 上耐受HLA配型不符，其間充質干細胞更為原始，擴增能力較骨髓間充質干細胞更強，故廝 血干細胞的作用越來越突出，可用于各系統疾病的細胞移植治療和作為基因治療的載體。 廝血來源的造血干細胞已經用于治療血液系統疾病，如白血病患者造血系統重建，但是廝 血來源的間充質干細胞的應用價值始終沒有被挖掘。在目前的廝血庫中，存儲的自體廝血 使用幾率較小，而公共廝血庫中單份廝血造血干細胞的數量往往不能滿足治療需求，由于 W上兩方面的原因，95% W上儲存的廝血未得到使用，因此廝血間充質干細胞的市場開發價 值潛力巨大。
[0004] 廝血間充質干細胞出現在妊娠前H個月的的胎兒血液循環中，12周W后間充質干 細胞的數量開始下降，逐漸在胎兒血液中幾近消失。據統計出生后廝血間充質干細胞在單 個核細胞中的比例僅0. 001-0. 01%。有文獻報道從118例廝血中僅成功分離到11例，成功率 僅10%左右，成功率高的也僅能達到20%-35%左右。廝血間充質干細胞的分離方法主要是通 過貼壁方法，但是廝血中不成熟的間充質干細胞貼壁能力較弱，按照貼壁法會損失部分細 胞。而采用密度梯度離也法、流式細胞分選法則由于廝血總量的個體間差異和特異性標志 物缺乏的原因，提取出來的廝血間充質干細胞極少，細胞生長狀態不好。專利（CN1878860B) 采用密度梯度離也法結合細胞因子誘導的方法提高廝血間充質干細胞培養的成功率，但是 胎牛血清的引入易造成異種蛋白致敏，另外細胞因子易造成廝血間充質干細胞的誘導分 化，該就限制了其臨床應用的范圍。
[0005] 間充質干細胞盡管有巨大的治療潛能，但是到目前為止尚沒有公認的細胞表面標 志物，國際細胞治療協會通過CD29, CD44, CD73, CD90和CD105等細胞表面標志物來協助鑒 定未分化的間充質干細胞，其標準主要由骨髓間充質干細胞發展而來。CD90,又稱化y-1， 是細胞黏附分子免疫球蛋白超家族的成員，已確定在非淋己組織的多種干細胞如成纖維細 胞、腦細胞及活化的內皮細胞中均有不同程度的表達。CD90蛋白在細胞黏附、外滲和轉移中 起作用。
[0006] 細胞外基質蛋白是由動物細胞合成并分泌到胞外，分布在細胞表面或細胞之間的 大分子蛋白或蛋白聚糖。該些物質構成復雜的網架結構，支持并連接組織結構、調節組織 的發生和細胞的生理活動。細胞外基質是動物組織的一部分，不屬于任何細胞，一方面為 細胞和組織提供支持、聯結、固定、保水、緩沖等物理性的保護作用，另一方面又是細胞與外 環境進行物質交換、信息傳遞和匯集的中介。它可通過各種信號傳遞系統，調節細胞生長、 增殖、遷移、分化、粘附、代謝、損傷修復、組織重構等各種生理功能，被稱為是人體細胞和組 織內穩態的主要調節者。細胞外基質的成分十分復雜，除了各型膠原W外，還有各種粘連蛋 白、纖連蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖等幾十個類別。
[0007] 纖連蛋白，也稱纖維連接蛋白，是一種高分子糖蛋白，具有多種生物學功能，廣泛 存在于動物組織中，屬于細胞外基質蛋白的一種。其主要功能是介導細胞粘著。純化的 纖連蛋白可增強細胞之間及細胞與基質間的連接，如細胞表面受體、膠原、纖維蛋白和硫酸 蛋白。另外纖連蛋白可W通過細胞信號轉導途徑調節細胞的形狀，促進細胞鋪展。在胚 胎發育過程中，纖連蛋白對于許多類型細胞的遷移和分化是必需的；在細胞培養過程中使 用纖連蛋白可促進細胞生長，提高貼壁率，增強細胞代謝水平，縮短細胞培養時間。專利 (CN102876630A)使用層連蛋白和明膠蛋白結合促進細胞貼壁，并使用細胞因子進行誘導可 成功培養廝血間充質干細胞，但是細胞的貼壁屬非特異性，細胞純度受影響。而細胞因子的 使用也存在誘導分化的問題。專利（CN102449141A)使用骨髓間充質干細胞產生的細胞外 基質蛋白用于廝血間充質干細胞的貼壁，存在促貼壁蛋白成分復雜，細胞非特異貼壁的問 題。
[0008] 截止目前，從廝血中分離提取有核細胞的方法有兩類，第一類是根據細胞不同的 性狀，如細胞大小、密度、表面電荷W及黏附能力等的差異進行分離。Percoll和Ficoll是 目前常用的細胞分離液，其分離血細胞的原理是利用各種細胞密度的差異，將其分離于自 上而下的不同液體層次中。Percoll由表面黏附有聚己帰化咯麗的膠體娃組成；Ficoll主 要由葡聚糖和泛影酸軸組成，國產淋己細胞分離液主要成分為聚藏糖或葡聚糖與泛影酸葡 甲胺或泛影酸軸，其密度為（1. 0770 + 0. 0001) 3/111以可分離比人淋己細胞密度小的單個核 細胞群，包括單核細胞、間充質干細胞、造血干細胞等。在使用過程中，如果所需分離的標本 量較少，使用細胞分離液能形成較好的單核細胞層，也方便收集；但如果需要分離的標本量 較多，不但分離液使用量大，且離也后部分紅細胞仍然可能息浮在分離液中，致使收集細胞 混雜較多紅細胞，而紅細胞層內也混雜有核細胞，致使細胞得率在20%-40%之間。第二類 是利用細胞表面抗原性不同分離細胞的方法，如磁珠法，免疫英光標記法，流式細胞分選法 等，該些方法所存在的共同問題是；一是無公認的干細胞標志物；二是造價太貴；H是在標 記過程中可能對細胞造成損傷。專利（CN102002479A)中使用流式分選CD105陽性的細胞 用于組織工程種子細胞，但是使用的是經過培養的貼壁細胞然后再進行分選，存在的問題 是單一標志物的特異性不高，廝血間充質干細胞前期培養時間較長的難點沒有解決。
[0009] 生理學上體內細胞氧含量在1-13%范圍內，但大部分細胞培養在21%氧氣濃度下。 培養基內氧濃度可W隨著外界氧濃度的降低而同步降低。可W通過調節細胞培養箱內的氧 濃度即可改變培養基中的氧環境。間充質干細胞主要在體內低氧的環境中生長，低氧更符 合其生理狀態，富氧反而對細胞具有損傷作用。目前研究表明，低氧培養可提高間充質干細 胞的增殖能力，遷移能力及黏附能力，并降低細胞衰亡率。但是低氧下會產生更多地乳酸， 作為代謝副產物，過多的乳酸會對細胞產生毒性，限制細胞進一步生長，因此選擇合適的低 氧條件至關重要。
[0010] 最初，動物細胞的體外培養均依賴于胎牛血清，該樣細胞在體外細胞才能較好的 增殖生長。但由于胎牛血清成分復雜，使用含血清的培養基培養細胞存在潛在的細胞毒性 作用、外源病毒和致病因子污染問題，使細胞培養的標準化和終產品純化難度加大，異種血 清的殘留也易導致臨床上的過敏反應。因此，動物細胞無血清培養基的開發和應用勢在必 行。所謂無血清培養基，是指不含有動物血清或其他生物提取液，但仍可W維持細胞在體外 較長時間生長、繁殖的一種培養基。細胞工程中無血清培養技術的應用，在很大程度上可W 避免含血清培養所帶來的不利。
【發明內容】
[0011] 針對上述問題，本發明提供一種廝血間充質干細胞的分離及培養方法，通過模擬 間充質干細胞體內低氧環境，使用間充質干細胞表面標記物和纖連蛋白促進廝血間充質干 細胞貼壁并使用無血清培養體系，可有效提高廝血單個核細胞的回收率和廝血間充質干細 胞培養的成功率。
[0012] 為實現本發明的上述目的，本發明提供一種廝血間充質干細胞的分離及培養方 法，包括W下步驟。
[0013] 步驟1、廝血的采集及運輸。
[0014] 步驟2、使用分離液對廝血中的單個核細胞進行提取和收集，并對剩余紅細胞組分 中的單個核細胞再次分離和提取。
[0015] 步驟3、洗涂兩次收集的單個核細胞。
[0016] 步驟4、將非特異性促貼壁蛋白及特異性促貼壁蛋白包被在培養瓶底部。
[0017] 步驟5、使用無血清培養體系混息單個