一株產耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株產耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌。
【背景技術】
[0002]α-淀粉酶全稱為α-1，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉時，可從分子內部切開α -1，4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為α-構型，故得名為α-淀粉酶。
[0003]耐高溫α-淀粉酶廣泛存在于動物(唾液、胰臟)、植物(大麥)和微生物中，是一種內切葡萄糖苷酶。它能在較高的溫度下迅速水解淀粉分子中的α-1，4葡萄糖苷鍵，任意切割淀粉成長短不一的短鏈糊精和少量的低聚糖、葡萄糖和麥芽糖，從而使淀粉糊的粘度迅速下降，是目前最重要的工業酶制劑之一，約占酶制劑市場份額的25%。耐高溫α-淀粉酶不同于中溫α-淀粉酶和普通高溫α-淀粉酶，具有優越的耐熱性能、酶活力高和較寬的pH適應范圍等特性，廣泛應用于造紙、紡織、印染、檸檬酸、乳酸發酵、啤酒、酒精、味精、淀粉糖(葡萄糖、飴糖、糊精、果糖、低聚糖)等工業領域，用量大，市場占有率高，應用前景非常廣闊。
[0004]耐高溫α -淀粉酶的來源主要為古菌和真細菌，最適作用溫度都在60°C以上，古菌一般在各種極端的條件下生存，如高溫、高滲、強酸、強堿等，維持它們的生命活動的很多蛋白質也是適應其生存環境的。因此，古菌來源的耐高溫α-淀粉酶較真細菌能耐受更高的溫度，雖然古菌α -淀粉酶耐熱性能較好，但它們最適生長溫度較高，多為80°C以上，生長條件較為苛刻，并不適合工業化生產的要求。因此，芽孢桿菌屬仍然是研究的重點。從50年代開始，人們就著手從高溫土壤中篩選出發菌株來研究耐高溫α-淀粉酶。近年來人們對高溫土壤中，特別是溫泉附近土壤中，篩選到了耐高溫α -淀粉酶的凝結芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌，可見高溫菌在耐高溫α-淀粉酶研究中仍然十分重要。自1973年Madsen等報道了采用常溫地衣芽孢桿菌得到了一種新的耐高溫α -淀粉酶開始，人們嘗試從中溫菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中獲得耐高溫α -淀粉酶，這給耐高溫α-淀粉酶的研究開辟了一條新途徑。目前工業化應用的耐高溫α-淀粉酶多是來自常溫牙抱桿囷屬。
[0005]枯草芽孢桿菌是當今工業酶制劑生產應用最廣泛的菌種之一。由于枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用的營養物質種類十分豐富，這決定了其自身含有豐富的產酶系統，具備生產多種酶的應用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β -葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。據不完全統計，枯草芽孢桿菌所產的酶占整個酶市場的50%。并且產酶量高、種類多、安全性好和環保，在現代工業生產中被廣泛用作生產菌種。
[0006]中國專利CN102363761A公開了一種產耐高溫α -淀粉酶菌種的優化方法，采用地衣芽孢桿菌10181從菌種活化、菌種擴培到發酵提取整個過程進行優化，該菌種所產的耐高溫α -淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受溫度為95°C。中國專利CN101838635A公開了一種耐高溫淀粉酶的制備方法，將地衣芽孢桿菌進行菌種復壯培養、種子培養，經液體深層發酵而成的耐高溫α-淀粉酶其酶活力高達20000-22000u/ml，耐受溫度高達110°C。中國專利CN100415879C公開了耐酸耐高溫的α -淀粉酶及其制備方法，用重組DNA技術定點突變前體α -淀粉酶，從微生物特別是地衣芽孢桿菌中分離前體α -淀粉酶基因，對其L134及S320的氨基酸殘基進行突變，并在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等細菌中高效表達α -淀粉酶突變體，較適宜在枯草芽孢桿菌中表達，使耐酸ΡΗ4.0-4.5，且高溫70-900C的α -淀粉酶得以高效表達.α -淀粉酶突變體具有良好的酸穩定性，更適于工業化應用，為耐酸性、耐高溫α-淀粉酶的工業化大生產提供了一條可行途徑。
[0007]如上所述，隨著生物技術的發展，會有更多的分離菌、誘變菌、基因工程菌及其組合會應用到耐高溫α-淀粉酶的生產中來，以滿足日益增長的工業化生產需求。
[0008]目前，雖然有很多本領域技術人員對生產耐高溫α-淀粉酶進行了不懈研究，但仍然存在以下不足:1.酶活力低，后處理工序復雜、生產成本相對較高；2.耐受的溫度很難超過95°C，液化效果不理想；3.最適pH值范圍較狹窄，不適合“二酶法”生產工藝；4.發酵及提取過程含有雜質，應用范圍受到限制。為了降低生產成本、拓展作用條件及范圍，滿足市場需求，需要開發或者優化出一株產酶活力高、作用條件寬泛的菌株，直接篩選出具有生產穩定性好、菌種適應強的出發菌株是很多研究的初始步驟。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一株生產耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌。
[0010]本發明提供的產耐高溫α-淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為 CGMCCN0.7926。
[0011]所述菌株特點如下:
[0012]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0013]所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02由一株保藏于本實驗室的產耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2010經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0014](I)菌懸液的制備
[0015]將在平板劃線分離后長出的L1-2010單菌落接入種子培養基中，100r/min，40°C培養12h后,取ImL培養液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0016](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0017]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經過照射的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C振蕩處理40min，將處理過的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0018](3)高產菌種的初篩
[0019]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-A，L1-2013-02，L1-2013-B
[0020](4)搖瓶發酵復篩
[0021]將獲得的三株菌L1-2013-A，L1-2013-02, L1-2013-B在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中進行搖瓶發酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養72h，離心取發酵上清液制得粗酶液。
[0022](5)酶活測定
[0023]酶活單位的定義:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0024]經測定，菌株L1-2013-02，為穩定的最高產菌株，且酶活達到31500U/mL。
[0025]所述氯化鋰平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0026]所述的種子培養基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0027]所述的發酵培養基:玉米粉5%?15%，豆餅粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2%?
[0028]所述的搖瓶培養條件:該菌在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發酵培養 72h。
[0029]由菌株Kl-1發酵獲得了一種耐高溫的α-淀粉酶，其酶學性質如下:
[0030](I)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在101-110°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩定性較好，而110°C以上保存長時間溫度穩定性較差。
[0031](2)該酶最適反應pH值為4-5。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時酶活完全穩定。
[0032](3)酶活性:由本發明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活