一種月季黑斑病菌的保存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物真菌的保存方法，具體涉及一種月季黑斑病菌的保存方法。
【背景技術】
[0002]月季黑斑病是由薔薇盤二孢(Marssonina rosae)引起的一種病害，是月季露地栽培最嚴重和最普遍的一種病害。該薔薇盤二孢(Marssonina rosae)真菌的分離、純化、繁殖和保存是開展月季種質資源黑斑病抗性鑒定、月季黑斑病菌毒性基因遺傳學、病原和寄主互作關系和月季黑斑病菌生理小種分化等研宄工作的基礎。現有技術的保存方法是將該菌接種到PDA培養基(土豆+葡萄糖+瓊脂)上保存，一般可保存菌種3-5個月，持續保存需要每隔3-5個月重新更換培養基和重新接種。現有技術的保存方法不僅費時費力，而且菌種的致病力逐漸降低。因此，選擇一種合適的月季黑斑病菌的保存方法勢在必行。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種能夠使月季黑斑病菌保存時間更長，同時仍能保持強有力的致病力，方法更簡單、更能增加實用性的月季黑斑病菌的保存方法。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0005]一種月季黑斑病菌的保存方法，包括以下步驟:
[0006](I)月季黑斑病菌的分離和純化培養
[0007]①將感染了黑斑病菌的月季葉片放入體積分數為70%乙醇溶液20s，再用無菌蒸餾水清洗2-3次，展開葉片將其平鋪在盛有質量分數為I %瓊脂的培養皿中，在室內光照強度為1800-32001x，光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對濕度90-100 %，室溫18-28°C的條件下培養24-48h ；
[0008]②在解剖鏡下用已滅菌的挑針從培養皿中分離出單個的萌芽真菌孢子，將其轉移到盛有營養培養基的培養皿中，在室內黑暗條件下，且空氣相對濕度90-100%，室溫為18-28°C培養4-5周，所述的營養培養基由以下重量份的成分混合而成:麥芽3.5份、酵母2份和瓊脂2份；
[0009](2)月季黑斑病菌的活力性檢測
[0010]用無菌蒸餾水將步驟(I)②培養皿中的營養培養基洗掉，保留培養皿中的真菌菌落并轉移到離心管中，在3000-5000轉/分的條件下離心10-15min，將上清液轉移到已滅菌的容器內，每次取出上清液lml，用質量分數為0.07%的酚藏花紅溶液進行真菌孢子的活力性檢測，有活力的孢子不變色，失去活力的孢子變紅，當孢子活力性檢測值小于90%時，說明孢子活性不夠，繼續維持步驟(I)②所述培養至檢測出孢子活力性檢測值大于或等于90%，當孢子活力性檢測值大于或等于90%時，將容器內上清液中的孢子濃度用無菌水調至1 X 105-2X 106個/ml用于接種備用；
[0011](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0012]①繁殖:用噴霧法或滴液法將步驟(2)檢測得到的孢子活力性檢測值大于或等于90%，且該孢子溶液濃度調至1 X 105-2X 106個/ml的孢子接種到經消毒處理的對月季黑斑病敏感的月季品種的離體葉片上或接種到經消毒處理的對月季黑斑病敏感的月季野生種的離體葉片上，將接種后的離體葉片平鋪于保濕的培養皿中，在室內光強1800-32001x、光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對濕度90-100%，室溫18_28°C的條件下培養7-14d;所述保濕的培養皿為將已滅菌的棉花平鋪于培養皿中，在棉花上滴加1ml的無菌水；
[0013]②保存:
[0014]取出步驟(3)①培養皿中的離體葉片，用無菌濾紙吸干該葉片表面的水分后裝入容器中，立刻將該容器放入液氮中速凍5-15min后，取出再放入_70°C?_80°C的超低溫冰箱保存；
[0015](4)月季黑斑病菌的復活
[0016]從超低溫冰箱中取出容器立刻放入4°C的環境中，待解凍后，將容器內的離體葉片平鋪于保濕的培養皿中，在室內光強1800-32001x、光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對濕度90-100%、室溫18-28°C的條件下培養以備用；所述保濕的培養皿與步驟(3)①所述的保濕的培養皿的保濕方式相同。
[0017]進一步，步驟(3)①繁殖中所述的消毒處理是:采集對月季黑斑病菌敏感的月季品種完全展開的無病蟲害的葉片或對月季黑斑病菌敏感的月季野生種的完全展開的無病蟲害的葉片，先將采集的葉片進行解剖鏡鏡檢，確保所采集的葉片無任何真菌菌落或菌絲后，用質量分數為0.8%的次氯酸鈉處理20s，再用體積分數為70%乙醇處理20s，然后用無菌的蒸餾水清洗2-3次，用無菌的濾紙吸干葉片表面的水分。
[0018]與現有技術相比，本發明的主要創新點和有益效果是:
[0019]1、本發明所述月季黑斑病菌的分離和純化培養步驟的參數能使月季黑斑病菌生理小種得到很好的分化和純化培養，能準確地分離出月季黑斑病菌的某一個生理小種。而現有技術不能提供這些參數，幾乎忽略了此步驟的重要性，因而不能很準確地分離出月季黑斑病菌的某一個生理小種，病菌生理小種的混合保存法將不利于后續的不同生理小種分化和抗性鑒定等實驗的開展和深入。
[0020]2、本發明中月季黑斑病菌的保存介質是對月季黑斑病敏感的月季葉片，其效果是保存時間更長，保存期間無須額外的重新更換培養基和重新接種等繁雜的步驟。而現有技術保存介質是PDA培養基(土豆+葡萄糖+瓊脂)，只能保存菌種3-5個月，持續保存需要每隔3-5個月重新更換培養基和重新接種，不僅費時費力，而且菌種的致病力逐漸降低。
[0021]3、本發明對孢子活力性的檢測和范圍值在接種保存前進行了實施和規定，其效果是月季黑斑病菌在_80°C冰箱中保存3年后，其活力依然很強，其致病力保持不變，致病力達到100%。
[0022]綜上所述，本發明方法各步驟的協同作用，使月季黑斑病菌的保存期延長至3年，其保存期比現有技術增長6.2-11倍，且保存36個月后，其病菌活力仍達到于90 %以上，比現有技術保存的病菌活力提高100%，病菌致病力提高100%，產生了預料不到的技術效果O
【具體實施方式】
[0023]以下實施例無特殊說明為常規方法。
[0024]實施例1 (本發明方法)
[0025](I)月季黑斑病菌的分離和純化培養
[0026]①將感染了黑斑病菌的月季葉片放入體積分數為70%乙醇溶液20s，再用無菌蒸餾水清洗3次，展開葉片將其平鋪在盛有質量分數為I %瓊脂的培養皿中，在室內光照強度為20001x、光周期為16h光期、8h暗期，空氣相對濕度95%、室溫23°C的條件下培養36h ；
[0027]②在解剖鏡下用已滅菌的挑針從培養皿中分離出單個的萌芽真菌孢子，將其轉移到盛有營養培養基的培養皿中，在室內黑暗條件下，且空氣相對濕度95%、室溫23°C培養5周，所述的營養培養基由以下重量份的成分混合而成:麥芽3.5份、酵母2份和瓊脂2份；
[0028](2)月季黑斑病菌的活力性檢測
[0029]用無菌蒸餾水將步驟(I)②培養皿中的營養培養基洗掉，保留培養皿中的真菌菌落并轉移到離心管中，在4000轉/分的條件下離心12min，將上清液轉移到已滅菌的容器內，每次取出上清液lml，用質量分數為0.07%的酚藏花紅溶液進行真菌孢子的活力性檢測，有活力的孢子不變色，失去活力的孢子變紅，當孢子活力性檢測值小于90%時，說明孢子活性不夠，繼續維持步驟(I)②所述培養至檢測出孢子活力性檢測值大于或等于90%，當孢子活力性檢測值大于或等于90%時，將容器內上清液中的孢子濃度用無菌水調至1 X 105-2X 106個/ml用于接種備用；所述質量分數為0.07%的酚藏花紅溶液的配制是:0.07g酚藏花紅溶解于10ml無菌水。
[0030](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0031]①繁殖:用噴霧法或滴液法將步驟(2)檢測得到的孢子活力性檢測值大于或等于90 %，且該孢子溶液濃度調至I X 105-2 X 16個/ml的孢子接種到經消毒處理的對月季黑斑病敏感的月季品種‘云彩虹’的離體葉片上，將接種后的月季離體葉片平鋪于保濕的培養皿中，在室內光強20001x、光周期為16h光期、8h暗期，空氣相對濕度95%、室溫23°C的條件下培養14d ;所述保濕的培養皿為將已滅菌的棉花(棉花厚度為0.5cm)平鋪于培養皿中，在棉花上滴加1ml的無菌水；對月季黑斑病敏感的月季品種‘云彩虹’的離體葉片的消毒處理是:采集對月季黑斑病菌敏感的月季品種‘云彩虹’完全展開的無病蟲害的葉片，先進行解剖鏡鏡檢，確保所采集的葉片無任何真菌菌落或菌絲后，用質量