用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微加工技術與組織工程技術領域，尤其涉及用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片及方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國人口老年化程度的不斷加劇，同時由于遺傳因素及環境因素的影響，中樞神經系統疾病逐漸成為臨床醫學專家們需要面對的一項重要挑戰。長期以來，基于對神經退行性病變機理的研宄，人們一直以神經細胞為作用對象，以單一靶點作為研宄目標，試圖以神經保護的治療策略來阻止神經退行性疾病的發生發展。然而，針對神經系統的疾病，單一的細胞內途徑或細胞類型是遠遠不夠的，有效的治療策略必須超越單一的治療革巴點。神經血管單元(neurovascular unit, NVU)提供了一個大腦發生退行病變后更為全面的整合的治療靶點。此概念的提出旨在強調神經元、神經膠質細胞和血管內皮間相互聯系及相互影響的重要性，并將三者放在一個微小的三維環境中研宄，為整體研宄神經元損傷及保護機制、尋找臨床治療的新靶點提供依據。
[0003]構建一種與載體相似的、由“神經血管單元”主要結構和功能細胞組成的體外共培養模型，用于腦神經血管疾病的病理生理研宄及其防治藥物的篩選，具有極為重要的意義。目前國內外有利用transwell培養小室為媒介建立體外“神經血管單元”模型的研宄報道，也有不少學者通過腦片培養來體外模擬神經血管單元。但是利用新興的微流控芯片(microfludic chip)來模擬神經血管單元尚不多見，且其側重點多用于構建一種新型的體外血腦屏障(Blood Brain Barrier, BBB)來用于中樞神經系統藥物的篩選，并不是神經血管單元模型。因為其未能充分而科學的理解腦中神經血管相互聯系與影響之網絡，只是建立起神經血管單元中星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞聯系而忽略了星形膠質細胞與神經元的直接聯系，或者是建立了星形膠質細胞與神經元直接聯系而忽略了其同樣也與腦微血管內皮細胞的直接接觸關系。目前體外建立神經血管單元細胞模型多使用以transwell培養小室為媒介，此模型雖然結合原代神經細胞培養技術及大鼠腦微血管內皮細胞培養技術，將神經元、星形膠質細胞及腦微血管內皮細胞培養在一個立體的三維空間體系中，但是由于transwell小室結構構造的限制，以上三種細胞只能實現其中立體空間上的兩種直接接觸聯系。與大腦中星形膠質細胞作為橋梁共同連接其他兩種要素細胞的真實構架(神經元一星形膠質細胞一腦微血管內皮細胞)仍有較大差距。故目前亟待一種新的裝置來實現立體或者平面空間上神經血管單元中星形膠質細胞作為中間橋梁連接神經元和微血管內皮細胞。
[0004]微流控芯片技術作為一門迅速發展起來的科學技術，已經在生物醫學領域展現了其獨特的優勢，更因其同細胞尺寸匹配、環境同生理環境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設計實現多種細胞功能研宄等特點而成為新一代細胞研宄的重要平臺。它對于實驗結果能夠實時追蹤和原位觀察，給研宄腦疾病尤其是腦血管疾病的基礎研宄提供一個穩定科學的平臺。2011年Devi Majumdar和他的同事實現了大鼠海馬神經元和星形膠質細胞在微流控芯片上的共培養生長。Ross Booth等利用多層次微流控芯片裝置、腦微血管內皮細胞及星形膠質細胞細胞系在體外模擬血腦屏障(BBB)。AKHAchyuta等在微流控芯片立體空間上模擬神經血管單元，其中上池是腦微血管內皮細胞細胞層，下池是星形膠質細胞、神經元和小膠質細胞的混合培養，但該模型存在的較大缺陷是未實現星形膠質細胞的足突直接連接腦微血管內皮細胞層。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提出用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片及方法，能夠非常簡單地實現星形膠質細胞的足突直接連接腦微血管內皮細胞層，同時又能與神經元細胞層建立聯系，實現了單個星形膠質細胞的足突即連接腦微血管內皮細胞同時又連接神經元胞體。
[0006]為達此目的，本發明采用以下技術方案:
[0007]一種用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片，包括:位于中間的第一流道，位于第一流道兩側且呈回形彎曲的對稱結構的第二流道和第三流道，以及用于連接第一流道與第二流道、第一流道與第三流道的細流道；
[0008]所述第一流道，用于接種神經血管單元中的星形膠質細胞；
[0009]所述第二流道，用于接種神經血管單元中的神經元；
[0010]所述第三流道，用于接種神經血管單元中的腦微血管內皮細胞。
[0011]其中，所述第一流道、第二流道、第三流道的池深均為40-60 μ m，所述細流道高度為 5-10 μm。
[0012]一種用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片的制造方法，包括:
[0013]步驟1、在襯底材料上通過光刻技術制作細流道；
[0014]步驟2、在襯底材料上通過光刻技術制作第一流道、第二流道及第三流道；
[0015]步驟3、使用PDMS倒模復制出光刻的模板結構；
[0016]步驟4、與玻璃基底封接以形成封閉的流道，完成微流控芯片結構的制造。
[0017]其中，在步驟I之前，還包括:選擇襯底材料；
[0018]所述步驟1、在襯底材料上通過光刻技術制作細流道，包括:
[0019]勻膠，將光刻膠滴在襯底材料上，利用勻膠機完成涂膠；
[0020]軟烘，對涂膠后的襯底材料進行兩級加熱；
[0021]光刻，利用光刻機及第一掩膜板制作出細流道光刻膠結構。
[0022]其中，所述光刻膠的型號為SU8-3005，滴在襯底材料上的光刻膠的量為0.5-1.5mL，所述勻膠機的轉速為2500-3500rmp，所述勻膠機的轉動時間為20_60s，涂覆光刻膠的厚度為5-10 ym;
[0023]所述兩級加熱，包括:60-70°C溫度下烘烤1-2分鐘，90-100°C溫度下烘烤2_4分鐘。
[0024]其中，所述滴在襯底材料上的光刻膠的量為lmL，所述勻膠機的轉速為3000rmp，所述勻膠機的轉動時間為30s ；
[0025]所述兩級加熱，包括65°C溫度下烘烤I分鐘，95°C溫度下烘烤3分鐘。
[0026]其中，所述步驟2、在襯底材料上通過光刻技術制作第一流道、第二流道及第三流道，包括:
[0027]勻膠，將光刻膠滴在細流道光刻膠結構上，利用勻膠機完成涂膠；
[0028]軟烘，對涂膠后的襯底材料進行兩級加熱；
[0029]光刻，利用光刻機及第二掩膜板制作出第一流道、第二流道及第三流道的光刻膠結構。
[0030]其中，所述步驟2中的所述光刻膠的型號為SU8-3050，所述勻膠機的轉速為2500-3500rmp，所述勻膠機的轉動時間為20_60s，涂覆光刻膠的厚度為40-60 μπι ;
[0031]所述步驟2中的所述兩級加熱，包括:60-70°C溫度下烘烤1-2分鐘，90-100°C溫度下烘烤2-4分鐘。
[0032]其中，所述步驟2中的所述勻膠機的轉速為3000rmp，所述勻膠機的轉動時間為30s，所述兩級加熱，包括65°C溫度下烘烤I分鐘，95°C溫度下烘烤3分鐘。
[0033]其中，所述步驟2還包括:
[0034]堅膜烘焙，對細流道光刻膠結構以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻膠結構進行兩級加熱；
[0035]顯影，利用顯影液將細流道光刻膠結構以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻膠結構中的沒有固化的光刻膠去除；
[0036]最后堅膜。
[0037]其中，所述堅膜烘焙中的兩級加熱，包括:60-70°C溫度下烘烤1-2分鐘，90_100°C溫度下烘烤2-4分鐘；
[0038]所述顯影液為SU8顯影液；
[0039]所述最后堅膜的溫度為130_170°C。
[0040]其中，所述堅膜烘焙中的兩級加熱，包括:65°C溫度下烘烤I分鐘，95°C溫度下烘烤3分鐘；
[0041]所述最后堅膜的溫度為150°C。
[0042]一種使用上述所述的用于建立三類細胞體外共培養模型的微流控芯片培養細胞方法，包括:
[0043]提取、純化神經元、星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞；
[0044]在微流控芯片結構的第一流道接種星形膠質細胞后，再在第二流道接種神經元，記錄二者生長狀態，并用TJUl標記神經元和用GFAP標記星形膠質細胞，觀察二者連接狀態；
[0045]在微流控芯片結構的第三流道接種腦微血管內皮細胞后，再在第一流道接種星形膠質細胞，記錄二者生長狀態，并用GFAP標記星形膠質細胞和vWF標記腦微血管內皮細胞，觀察二者連接狀態；
[0046]在微流控芯片結構的第一流道接種星形膠質細胞后，再在第三流道接種腦微血管內皮細胞，最后在第二流道接種神經元，調整培養條件，記錄三者生長狀態，并用GFAP標記星形膠質細胞、vWF標記腦微血管內皮細胞和TJUl標記神經元，觀察三者連接狀態。
[0047]其中，