一種用于藥物控釋和基因載體的溫度響應型聚合物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于高分子材料和生物醫學工程領域，具體涉及一種用于藥物控釋和基因載體的溫度響應型聚合物的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病，目前癌癥的治療方法可分為手術治療和非手術治療兩大類，其中化療是一種應用較廣泛的非手術治療方法。化療是利用化學藥物殺滅癌細胞的一種治療方法，但由于化療藥物的選擇性不強，在殺滅癌細胞的同時也會損傷人體正常細胞，因此需要研發高性能的載體材料用于控制藥物釋放，減輕對正常細胞的影響。
[0003]溫度響應型聚合物能夠根據外界溫度變化發生相轉變而改變自身結構，利用該特性可以達到藥物控釋的目的，是一種良好的藥物載體材料。2-甲基-2-丙烯酸-2- (2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)是兩種新型的溫度響應型材料，具有良好的生物相容性，近年來已成為一個新的研宄熱點。Lutz等(Journal ofthe American Chemical Society 2006, 128，13046-47)研宄分析了 MEO2MA 和 OEGMA 的最低臨界共溶溫度(LCST)，指出可以通過改變兩者的比例制備出具有不同LCST的溫度響應型無規共聚物，在生物醫藥領域具有一定的潛在應用性。
[0004]基因治療是一種新興的癌癥治療技術，是指將人類正常基因或有治療作用的基因導入癌細胞或組織，阻止癌細胞的生長、轉移、復發，以達到治療癌癥的目的。基因載體是將目的基因導入靶細胞的工具，一直以來都是基因治療的研宄重點之一，現如今常見的非病毒載體有脂質體、聚乙烯亞胺、殼聚糖等高分子材料。殼聚糖具有良好的生物相容性，且分子內含有許多氨基，在生理PH下會發生質子化而帶正電荷，能夠與基因上帶負電荷的磷酸基團產生靜電作用形成復合物，從而起到搭載外源基因的作用，但是殼聚糖存在分子量高、溶解性差、轉染率低等缺點，限制了其在基因載體領域中的應用。低分子量殼聚糖，又稱殼寡糖(Chitosan oligosaccharide, COS)是殼聚糖經過降解而得到的低聚合度寡糖產品，是自然界中唯一帶正電荷的陽離子堿性氨基低聚糖。殼寡糖不僅保留了殼聚糖的基本性能，而且還具有水溶性好、抗腫瘤、抗菌等優良特性，是一種理想的基因載體材料。
[0005]利用疏水性單體開環聚合制備出大分子引發劑，結合原子轉移自由基聚合，在大分子鏈上引入具有溫度響應性的親水鏈段MEO2MA和0EGMA，制備出兩親性嵌段共聚物，并結合點擊化學反應，在兩親性嵌段共聚物上引入親水性的殼寡糖分子鏈，制備出用于藥物控釋和基因載體的新型嵌段共聚物。這種兩親性嵌段共聚物在水溶液中能夠自組裝成具有溫度響應性的膠束，該膠束可以作為化學藥物和外源基因的載體材料，在生物醫學、藥物載體、基因治療等領域將具有良好的發展前景。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種用于藥物控釋和基因載體的溫度響應型聚合物的制備方法。
[0007]本發明的目的是依次將具有親水性的溫度響應型聚合物和帶有氨基基團的親水性殼寡糖引入到疏水性的生物可降解聚酯類大分子鏈段上，使獲得的兩親性嵌段共聚物具有良好的生物相容性、生物降解性、溫度響應性和陽離子特性，并能夠在水溶液中組裝成穩定的納米膠束。本發明以2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)、殼寡糖和環酯類單體為原料，采用開環聚合反應、原子轉移自由基聚合反應和點擊化學反應，制備一系列具有不同最低臨界共溶溫度(LCST)的溫度響應型嵌段共聚物。
[0008]本發明提出的用于藥物控釋和基因載體的溫度響應型聚合物的制備方法，具體步驟如下:
(1)將低分子量殼聚糖(殼寡糖COS)和鄰苯二甲酸酐(PA)按照摩爾比為1:2?6(以殼寡糖中的吡喃糖環計算摩爾比)計量加入到N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮氣或氬氣保護下反應，反應溫度為100?150°C，反應時間為4?12小時，待反應產物冷卻到室溫，將其加入到甲醇中沉淀，抽濾，并用甲醇重復洗滌抽濾3次，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物I鄰苯二甲酰化殼寡糖；
(2)將步驟(I)得到的鄰苯二甲酰化殼寡糖、4-戊炔酸、催化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和催化劑羥基苯并三唑(HOBt)按照摩爾比為1:4?8:4?8:2?4(以殼寡糖中的吡喃糖環計算摩爾比)計量加入到N，N-二甲基甲酰胺中，在氮氣或氬氣保護下室溫反應24?72小時。反應結束后，將產物加入到甲醇中沉淀，抽濾，再用N，N-二甲基甲酰胺溶解后經甲醇沉淀，重復3次，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物II炔基化鄰苯二甲酰化殼寡糖；
(3)將步驟(2)得到的炔基化鄰苯二甲酰化殼寡糖和水合肼(N2H4.Η20)按照摩爾比為1:5?10(以殼寡糖中的吡喃糖環計算摩爾比)計量加入到N，N-二甲基甲酰胺中，在氮氣或氬氣保護下反應，反應溫度為80?140°C，反應時間為4?8小時，待反應產物冷卻到室溫，將其加入到甲醇中沉淀，抽濾，并用甲醇重復洗滌抽濾至濾液無色為止，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物III炔基化殼寡糖，備用；
(4)將含有羥基官能團的引發劑A和環酯類單體B按照摩爾比為1:20?1000計量加入到反應Il中，按照單體總摩爾量的ο.οι?1%加入催化劑C，在氮氣或氬氣保護下反應，反應溫度為100?140°C，反應時間為12?36小時，待反應產物冷卻到室溫，加入二氯甲烷使其溶解，將溶液加入到甲醇中沉淀，抽濾，再用二氯甲烷溶解后經甲醇沉淀，重復3次，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物IV聚酯類高分子材料；
(5)將步驟(4)得到的聚酯類高分子材料和三乙胺(Et3N)按照摩爾比為1:4?50計量加入到二氯甲烷中，隨后將反應體系冷卻到0°C，并向其中逐滴滴加2-溴異丁酰溴溶液(用量為產物IV摩爾數的3?35倍，用二氯甲烷稀釋5?10倍)，0°C攪拌2小時后移至室溫下繼續反應36-72小時。反應結束后旋蒸濃縮，并依次用飽和NaHCO3S液和去離子水反復洗滌多次，用無水硫酸鎂除水后過濾、旋蒸濃縮，將溶液加入到甲醇中沉淀，抽濾，再用二氯甲烷溶解后經甲醇沉淀，重復3次，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物V原子轉移自由基聚合(ATRP)的大分子引發劑； (6)將步驟(5)得到的ATRP大分子引發劑、催化劑溴化亞銅、配體PMDETA、ME02MA單體和OEGMA單體按照摩爾比為1:2?20:2?20:10?1000:10?1000計量加入到四氫呋喃中，在氮氣或氬氣保護下反應，反應溫度為40?80°C，反應時間為5?10小時，待反應產物冷卻到室溫，用四氫呋喃稀釋后過中性氧化鋁柱子以除去銅鹽，旋蒸濃縮后透析除去未反應的單體，最后冷凍干燥得到產物VI溫度響應型嵌段共聚物；
(7)將步驟(6)得到的溫度響應型嵌段共聚物和疊氮化鈉(NaN3)按照摩爾比為1:10?30計量加入到N，N- 二甲基甲酰胺中，在40?60°C溫度下反應24?72小時。反應結束后旋蒸濃縮除去N，N- 二甲基甲酰胺，用四氫呋喃重新溶解產物后過中性氧化鋁柱子以除去殘留的鈉鹽，將溶液旋蒸濃縮后加入到正己烷中沉淀，抽濾，再用四氫呋喃溶解后經正己烷沉淀，重復3次，將過濾產物在40°C下真空烘干24h，得到產物VII疊氮化的溫度響應型嵌