一種抗BLyS單鏈抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體涉及抗B淋巴細胞刺激因子(BLyS)的單鏈抗體及其制備方法和醫藥用途。
【背景技術】
[0002]B淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS，也被稱為BAFF)最早于1999年由Moore等多個研宄小組獨立發現的一種全新的、具有重要免疫調節功能的細胞因子。BLyS屬于腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)超家族成員，是一個典型的II型跨膜單鏈糖蛋白。
[0003]BLyS由285個氨基酸組成，分子量大小約為31.3kDa，其胞外區134-285位氨基酸可在弗林蛋白酶的作用下發生水解，形成可溶性的功能片段。雖然BLyS能以膜結合的形式存在，但BLyS主要以可溶的同源三聚體形式與其受體結合發揮相應的生物學功能。目前發現的BLyS受體主要有三個:TACI，BCMA和BAFF-R。其中BLyS與BAFF-R為特異性結合，兩者的相互作用是B細胞賴以生存的必要條件。
[0004]BLyS可大量發現于外周血及淋巴組織細胞的培養上清中，其主要表達于諸如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞等先天固有的免疫細胞中；在IFNy、IL-10以及 G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等細胞因子的刺激下會增強BLyS的表達。BlyS具有明顯的B細胞趨向性并能特異性的結合B細胞，其對于B細胞的增殖、分化、成熟以及生存等方面發揮著非常重要的調控作用，而BLyS對由B細胞介導的自身免疫性疾病的過程以及T淋巴細胞瘤起著重要的影響。BLyS過表達與多種自身免疫性疾病有著密切的聯系，如系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)、肖格倫綜合征(Sjogren’sSyndrome，SS)、類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重癥肌無力(MyastheniaGravis，MG)等等(參見，例如，The complexity of the BAFF TNF-familymembers:1mplicat1nsfor autoimmunity.Lahiri A 等 J Autoimmun.2012Sep ；39(3):189-98.do1:0.1016/j.jaut.2012.05.009.Epub 2012Jun 29)。以 BLyS 為作用靶點的藥物，尤其以貝利木單抗為代表的單克隆抗體藥物等，在治療SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。
[0005]單鏈抗體(single chain variable fragment, ScFv)是通過基因工程將抗體的重鏈可變區(variable reg1n of heavy chain, VH)與輕鏈可變區(variable reg1n oflight chain,VL)通過一段連接肽而形成的一種重組蛋白。單鏈抗體既保持了親本抗體與抗原的結合特異性和相當的親和力，因為分子量小更容易進入腫瘤組織和細胞，發揮相應的作用；并且單鏈抗體不具有完整抗體的Fe段，因而其不會與補體受體結合，避免了全長I gGI的抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒性。
[0006]雖然目前噬菌體抗體庫為相對最成熟且應用最多的抗體庫技術，但是噬菌體抗體庫屬于原核表達體系，與真核表達體系存在差異，而表達系統差異越大，抗體改構后的活性發生改變的可能性就越大。哺乳動物細胞抗體庫屬于真核表達體系，它具有原核表達體系所不具備翻譯后修飾功能，而這也是決定蛋白生物活性的關鍵之一。由于本實驗室構建的哺乳動物細胞抗體庫是應用人源293T細胞建庫，因此獲得的抗體最近接天然人源抗體，在保證親和力的同時，也使所獲的候選抗體的免疫原性大大降低。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供能抗B淋巴細胞刺激因子抗體。
[0008]本發明提供了一種抗人B淋巴細胞刺激因子單鏈抗體，其具有選自下列可變區:
(a)重鏈可變區包括SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列；(b)輕鏈可變區包括SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列；(c)重鏈可變區包括SEQ ID N0:4所示氨基酸序列，且輕鏈可變區包括SEQ IDNO:6所示氨基酸序列；(d)重鏈可變區與SEQ ID N0:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區與SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
[0009]因此，目標抗體可能包含a) —個重鏈可變區，其氨基酸序列與序列4所示序列至少有約 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%gg 100%的一致性和 b) 一個輕鏈可變區，其氨基酸序列與序列6所示序列至少有約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。
[0010]在一個優選實施方案中，所述單鏈抗體的重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ IDNO:3，輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID N0:4。
[0011 ] 在一個優選實施方案中，編碼所述重鏈可變區的氨基酸序列的核苷酸序列為SEQID NO: 1，編碼所述輕鏈可變區的氨基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0012]另一方面，本發明提供了具有選自下列可變區的單鏈抗體:
[0013](a)重鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；(b)輕鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；(c)重鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，且輕鏈可變區的編碼基因包括SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列；(d)重鏈可變區的編碼基因能與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜交；或(e)輕鏈可變區的編碼基因能與SEQ ID NO:5所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜交。
[0014]一個優選實施方案中，所述單鏈抗體的重鏈可變區的編碼核苷酸序列為SEQ IDNO: 3，輕鏈可變區的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 5。
[0015]在一個具體實施方案中，本發明所述單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0016]在一個具體實施方案中，本發明所述單鏈抗體的編碼基因的核苷酸序列為SEQ IDN0:2o
[0017]另一方面，本發明提供了重組表達載體，其中含有編碼本發明所述單鏈抗體全長或可變區的核酸序列。
[0018]另一方面，本發明提供了宿主細胞，所述宿主細胞被本發明所述的重組表達載體所轉化。
[0019]本發明實驗證明，本發明提供的單鏈抗體與BLyS具有高親和力，BLyS過表達與多種自身免疫性疾病有著密切的聯系，如系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、肖格倫綜合征(Sjogren' sSyndrome, SS)、類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重癥肌無力(Myasthenia Gravis, MG)等。以BLyS為作用勒點的藥物在治療SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。
[0020]因此，另一方面，本發明提供了一種用于治療自身免疫病的藥物組合物，其包含有效量的作為活性成分的本發明所述的單鏈抗體和藥用載體。
[0021]術語“有效量”指可有效治療哺乳動物中的疾病或病癥的藥物量。
[0022]術語“藥效上可接受的載體”指一種或多種有機或無機成分，它可以使天然的或合成的，與抗體組合后可促進其應用。可接受的載體包括無菌的生理鹽水或是其他藥學上可獲得的且為本領域所熟知的水或非水的等滲溶液或滅菌混懸劑。
[0023]另一方面，本發明提供了一種針對自身免疫病的診斷試劑，其包含本發明所述的單鏈抗體、能夠產生可檢測信號的標記物及使用說明書。
[0024]另一方面，本發明提供了本發明所述單鏈抗體在制備用于治療自身免疫病的藥物中的用途。
[0025]另一方面，本發明提供了本發明所述單鏈抗體在制備自身免疫病的診斷試劑中的用途。
[0026]本發明中所述的自身免疫病包括但不限于系統性紅斑狼瘡、肖格倫綜合征、類風濕關節炎或重癥肌無力等。
[0027]本發明所述單鏈抗體的重鏈可變區中的⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 所示；輕鏈可變區中 CDRl、CDR2、CDR3 的氨基酸序列分別如 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12 所示。因此，
[0028]另一方面，本發明提供了一種抗人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體，其重鏈可變區中 CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列為 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9;和 / 或其輕鏈可變區中CDRU CDR2、CDR3的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO:12ο
[0029]可變區⑶R的變體與上述⑶R區可以有至多6個氨基酸殘基(例如，1、2、3、4或5個氨基酸取代)的取代，在具有CDR變體的單克隆抗體中，CDR區變體具有與B淋巴細胞刺激因子結合活性。
[0030]本發明所述單克隆抗體除了重鏈和輕鏈中的高度可變區⑶R1、⑶R2和⑶R3和鏈接序列外，其它為框架區。框架區可在結合所需的三維結構不受影響的條件下倍其他序列置換，抗體特異性的分子基礎主要來源于它的高變區⑶R1、⑶R2和⑶R3。這些區域是與抗原結合的關鍵部位。為維持優選的結合特性，CDR的序列應盡可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改變使結合特性最優化，本領域的技術人員可以用標準做法來達到此目的。
[0031]所述的單克隆抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、抗體片段或含有所述抗原結合結構域的任何多肽。
[0032]本發明所述“抗體”應該解釋為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因子。因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結合結構域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd,或者雙鏈抗體。融合至另一多肽的、包含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。
[0033]抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產生保留原來抗原特異性的其他抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或互補性決定區(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區