單克隆抗體mers-4及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單克隆抗體MERS-4及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 新型冠狀病毒（MERS-CoV)于2012年首次在中東地區被發現感染人類，隨后這種 病毒感染引起的疾病又先后出現在歐洲幾個國家和地區。超過半數的感染病人均會出現嚴 重的呼吸道疾病，其臨床癥狀同2003年爆發的由SARS-CoV的臨床癥狀非常相似。由于這 種疾病可以人傳染給人，引起了全世界的高度關注。到目前為止，還沒有特異性的藥物和疫 苗對這種疾病進行治療和預防。
[0003] MERS-CoV利用其表面的膜蛋白（S蛋白）進入易感細胞。S蛋白由位于N端的S1 結構域和位于近膜端的S2結構域和跨膜結構域組成，其中病毒對細胞易感性是由S1結構 域決定的。通過利用MERS-CoV的S1結構域進行共純化實驗，2013年初Raj的研究小組確 定了 dip印tideyl p印tidase4(DPP4,也稱為 CD26)為 MERS-CoV 的受體。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種單克隆抗體MERS-4及其編碼基因和應用。
[0005] 本發明提供了一種抗體，命名為單克隆抗體MERS-4,由A鏈和B鏈組成；所述A鏈 為如下（a)或（b): (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b)將序列1 的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的 由序列1衍生的蛋白質；所述B鏈為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列3所示的氨基酸 序列組成的蛋白質；（d)將序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質。
[0006] 所述A鏈和所述B鏈通過二硫鍵形成單克隆抗體MERS-4。
[0007] 本發明還保護一種DNA組合物，由編碼所述A鏈的DNA分子甲和編碼所述B鏈的 DNA分子乙組成。
[0008] 所述DNA分子甲可為如下（1)或（2)或（3)的DNA分子：（1)序列表中序列2自5' 末端第889-2274位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交 且編碼所述A鏈的DNA分子；（3)與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述 A鏈的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS和1XSSC、0. 1%SDS各洗膜一次。
[0009] 所述DNA分子乙為如下（4)或（5)或（6)的DNA分子：（4)序列表中序列4自5' 末端第889-1596位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交 且編碼所述B鏈的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述 B鏈的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 本發明還保護一種表達盒組合物，由表達所述DNA分子甲的表達盒甲和表達所述 DNA分子乙的表達盒乙組成。所述表達盒甲具體可如序列表的序列2所示。所示表達盒乙 具體可如序列表的序列4所示。
[0011] 本發明還保護一種質粒組合物，由重組質粒甲和重組質粒乙組成；所述重組質粒 甲為含有所述DNA分子甲或所述表達盒甲的重組質粒；所述重組質粒乙為含有所述DNA分 子乙或所述表達盒乙的重組質粒。所述重組質粒甲具體可為含有所述表達盒甲的PMD18-T 載體。所述重組質粒乙具體可為含有所述表達盒乙的PMD18-T載體。
[0012] 本發明還保護將所述重組質粒甲和所述重組質粒乙共轉染哺乳動物細胞得到的 重組細胞。所述哺乳動物細胞具體可為293T細胞。
[0013] 本發明還保護培養所述重組細胞得到的抗體（IgGl抗體)。
[0014] 本發明還保護一種藥物，其活性成分為所述單克隆抗體MERS-4;所述藥物的功能 為如下（I )、（ II )、（III)或（IV): (I )治療和 / 或預防MERS-CoV感染；（II )抑制MERS-CoV 增殖；CHI)抑制MERS-CoV入侵哺乳動物；（IV)治療和/或預防MERS-CoV引起的疾病。所 述"抑制MERS-CoV增殖"具體可為抑制MERS-CoV在哺乳動物細胞中的增殖。所述哺乳動 物細胞具體可為Huh7細胞。
[0015] 本發明還保護所述單克隆抗體MERS-4在制備藥物中的應用；所述藥物的功能為 如下（I )、（ II )、（III)或（IV) : ( I )治療和 / 或預防 MERS-CoV 感染；（II)抑制 MERS-CoV 增 殖；（III)抑制MERS-CoV入侵哺乳動物；（IV)治療和/或預防MERS-CoV引起的疾病。所述 "抑制MERS-CoV增殖"具體可為抑制MERS-CoV在哺乳動物細胞中的增殖。所述哺乳動物細 胞具體可為Huh7細胞。
[0016]本發明提供的單克隆抗體能夠有效抑制MERS-CoV入侵易感細胞，可作為 MERS-CoV的預防藥物或治療藥物，對于MERS-CoV的預防和治療具有重要的理論指導價值 和廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為MERS-4溶液的SDS-PAGE電泳圖。
[0018] 圖2為實施例2的步驟一至步驟四的中和活性結果；縱坐標為中和活性（％)，橫坐 標為稀釋液中的蛋白濃度以e為底的對數值。
[0019] 圖3為實施例2的步驟五的中和活性結果；縱坐標為中和活性（％)，橫坐標為稀釋 液中的蛋白濃度以e為底的對數值。
【具體實施方式】
[0020] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0021] 293T細胞（人腎上皮細胞系）：ATCC，ATC0? CRL-11268?。Huh7細胞(肝癌細胞 系）:JCRB，JCR B04〇3。TZM-BL 細胞（宮頸癌細胞系）：NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Cat. No. 8129)。pMD18_T 載體：Takara。pcDNA3.1(+)載體：Invitrogen 公司。骨架質粒 pNL4-3R-E_luciferase:參考文獻：He J，Choe S，Walker R，Di Marzio P，Morgan DO, Landau NR. J Virol69:6705 - 6711，1995.。
[0022] 實施例1、單克隆抗體的發現
[0023] 通過序列和模型分析發現MERS-CoV可能有一個潛在的受體結合域（Receptor Binding Domain, RBD)，將RBD和可溶性DPP4蛋白共結晶，解析蛋白的結構，發現RBD中有 與DPP4結合的關鍵氨基酸位點。利用純化的RBD進行動物免疫，發現其具有較強的誘導中 和抗體產生的能力。利用RBD篩選展示在酵母表面的人類非免疫scFvs文庫（scFvs的英文 全稱為"single-chain variable fragments"),得到了若干具有中和活性的單克隆抗體。 將其中一個單克隆抗體命名為單克隆抗體MERS-4 (屬于IgGl抗體)。
[0024] 實施例2、單克隆抗體MERS-4的制備
[0025] 1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA片段甲，然后將DNA片段甲插入pMD18-T 載體，得到重組質粒甲。
[0026] 序列表的序列2中，自5'末端第1-888位核苷酸為CMV啟動子，第889-2274位核 苷酸為單克隆抗體MERS-4的重鏈的編碼基因，第2275-2402為ployA。序列表的序列2所 不的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列1所不的蛋白質。
[0027] 2、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA片段乙，然后將DNA片段乙插入pMD18-T 載體，得到重組質粒乙。
[0028] 序列表的序列4中，自5'末端第1-888位核苷酸為CMV啟動子，第889-1596位核 苷酸為單克隆抗體MERS-4的輕鏈的編碼基因，第1597-1724為ployA。序列表的序列4所 不的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列3所不的蛋白質。
[0029] 3、將重組質粒甲和重組質粒乙共轉染293T細胞(轉染劑量：每IX105個細胞轉染 2微克重組質粒甲和2微克重組質粒乙，采用的培養基為含10%FBS的DMEM培養基)，37°C靜 置孵育8小時，然后將培養基更換為含2%FBS的DMEM培養基并37°C靜置孵育72小時(實際 應用中，48-72小時均可)，然后收細胞培養上清，4°C、4000rpm離心1小時，收集上清液。
[0030] 4、取步驟 3 得到的上清液，加入 protein A beads (Pierce?Protein A Agarose; Thermo公司），4°C振蕩孵育12小時，離心取上清液，即為含有單克隆抗體MERS-4的溶液(簡 稱MERS-4溶液)，4°C保存。
[0031] MERS-4溶液的SDS-PAGE電泳圖見圖1。由圖1可以觀察到，MERS-4溶液中并無 其它雜蛋白。分別回收兩個條帶并測序，一個條帶的前10位氨基酸殘基為序列表的序列1 的前10位，另一個條帶的前10位氨基酸殘基為序列表的序列3的前10位。
[0032] 實施例3、單克隆抗體MERS-4的應用
[0033] 一、檢測單克隆抗體MERS-4對MERS-CoV假病毒的中和活性
[0034] 表達MERS-CoV全長膜蛋白的質粒(命名為MERS-CoV膜蛋白質粒）和骨架質粒 pNL4-3R-E-lu CiferaSe共轉染293T細胞，孵育后能夠得到具有感染性但沒有復制能力的 MERS-CoV假型病毒，其感染性同活病毒相似。
[0035] 將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子（MERS-CoV全長膜蛋白的編碼基因）插入 pcDNA3. 1 (+)載體的Hindlll和Xhol酶切位點之間，得到MERS-CoV膜蛋白質粒。
[0036] 1、MERS-CoV假病毒的制備
[0037] 將MERS-CoV膜蛋白質粒和骨架質粒pNL4-3R-E_luciferase共轉染293T細胞， 37°C靜置孵育，轉染48小時后收集細胞培養上清，即為含有MERS-CoV假病毒的病毒液(簡 稱MERS-CoV病毒液)。利用p24定量檢測的ELISA試劑盒（HIV P24抗原定量檢測試劑盒， KEY-BIO, 96T)檢測MERS-CoV病毒液的病毒滴度，MERS-CoV病毒液的0D45Qnm (吸光值為1 (1021TCID50/ml)，吸光值越大說明病毒含量越高。
[0038] 2、檢測單克隆抗體MERS-4對MERS-CoV假病毒的中和活性
[0039] (1)采用含10%FBS的DMEM培養基將實施例2制備得到的MERS-4溶液倍比稀釋， 依次得到蛋白濃度為 50. 000000 ii g/ml、16. 666670ii g/ml、5. 555555ii g/ml、l. 851852ii g/ mUO. 6172839 u g/mUO. 2057613 u g/mU0.0 6858711 u g/mU0.0