重組紅鰭東方鲀干擾素調節因子2蛋白及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應于工業化生產的紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]紅鰭東方飩(Takifugu是一種重要的近海經濟魚類，由于其肉質細膩、味道鮮美深受人們的喜愛。在紅鰭東方飩的生殖腺和肝臟等內臟中產生的河豚毒素，其高活性和高特異性的生物特征具有潛在的醫藥開發價值，在臨床上具有廣闊的前景。然而，水環境中存在的大量細菌和病毒使魚類的皮膚和黏膜不斷受到侵襲，這些病原微生物侵入魚體后會使魚體發生病變甚至死亡，給紅鰭東方飩的大規模養殖造成嚴重損失。細胞因子是脊椎動物機體免疫系統調節免疫應答的一部分，在免疫系統的相關研究中占據重要地位。干擾素調節因子(IRFs)是一類結構上保守的轉錄因子家族，所有IRF在N端均包含一個由115個氨基酸殘基構成的具有螺旋-轉角-螺旋的DNA結合域(DNA binding domain, DBD),IRF通過DBD結合到特定的DNA基序上。IRF在干擾素的轉錄調控、免疫細胞(如樹突狀細胞、NK細胞和T細胞)的發育、細胞因子的信號轉導及抗腫瘤方面起到非常重要的作用。然而，從紅鰭東方飩中直接提取該蛋白的操作復雜、成本高、產量少，不能大規模產業化生產。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應于產業化生產的紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白的制備方法。
[0004]本發明的技術解決方案是:一種重組紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白，其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不,氨基酸序列號如SEQ ID NO:2所不。
[0005]一種上述重組紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行:
a.提取紅鰭東方飩腎臟總RNA，并反轉錄進行第一鏈的cDNA的合成；
b.以所得到的第一鏈的cDNA為模板、以具有NcoI和Xho I兩個酶切位點的RT-PCR反應引物進行RT-PCR反應；所述RT-PCR反應引物序列如下:
上游引物:5’ CATGCCATGGGCATGCCCGCAGAAAGAATGA 3’ ；
下游引物:5’ CCGCTCGAGGGAGGAAGTGACATCAGAGGTC 3’ ；
c.電泳回收RT-PCR產物與克隆載體pMD19T連接并轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5a，在含氨芐青霉素的LB固體培養基上培養，通過藍白斑篩選陽性克隆，選擇957bp大小的條帶進行回收；
d.用限制性內切酶NcoI和Xho I分別雙酶切c步驟所回收的產物和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5 α進行培養并提取重組表達質粒；
e.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內，挑取單菌落接種于含有氨節青霉素的5ml LB液體培養基過夜培養得到菌種；
f.將所收集的菌種進行擴大培養，經IPTG誘導后收集菌體；
g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。
[0006]所述RT-PCR反應條件為:94°C預變性5分鐘后進行94°C變性30秒、57 °C復性30秒、72°C延伸30秒的30個循環的擴增，72°C延伸7分鐘后保存于4°C。
[0007]所述f步驟是將所收集的菌種按1:100的比例接種于Amp LB液體培養基，37°C200轉/分搖菌2.5小時，至006(|(|為0.4，所搖菌液加誘導劑IPTG至終濃度為0.5mM, 37°C搖菌6小時，收集菌體；
所述g步驟是用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并將細菌裂解液12000轉，4°C離心20分鐘，將上清上樣于層析柱，用平衡液洗滌后加入300mM的咪唑洗脫收集洗脫液。
[0008]本發明根據克隆得到的紅鰭東方飩干擾素調節因子2基因的cDNA全長序列設計引物擴增該基因的蛋白編碼區并與PMD19T載體連接得重組質粒，經雙酶切后再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質粒并轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中；通過IPTG誘導實現了重組蛋白的可溶性表達。該表達質粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，將細胞破碎后取上清純化，避免了樣品的變性和復性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結構不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應于工業化生產，為進一步研究紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白的功能奠定基礎。
【附圖說明】
[0009]圖1本發明實施例紅鰭東方飩腎臟總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
[0010]圖2本發明實施例紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白目的基因的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
[0011]圖3本發明實施例重組表達質粒的雙酶切電泳鑒定圖。
[0012]圖4本發明實施例純化柱洗脫組分的SDS-PAGE分析圖。
[0013]圖5本發明實施例重組表達質粒表達產物的SDS-PAGE分析圖。
[0014]圖6本發明實施例重組表達質粒誘導表達的蛋白印跡分析圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例:
a.以TRIzol Reagent提取新鮮紅鰭東方飩腎臟總RNA并反轉錄進行第一鏈的cDNA的合成，紅鰭東方飩總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析圖如圖1所示，圖中M =Maker DL2000 ； I:紅鰭東方飩總RNA電泳條帶。
[0016]b.根據克隆獲得的紅鰭東方飩干擾素調節因子2基因的蛋白編碼區設計針對紅鰭東方飩干擾素調節因子2蛋白編碼序列的引物對，以上述第一鏈cDNA為模版進行PCR擴增，引物對的核苷酸序列為:
上游引物:5 ’ CATGCCATGGGCATGCCCGCAGAAAGAATGA 3，
下游引物:5’ CCGCTCGAGGGAGGAAGTGACATCAGAGGTC 3’
RT-PCR反應條件為:94°C預變性5分鐘后進行94°C變性30秒，57°C復性30秒、72°C延伸30秒的30個循環的擴增，72°C延伸7分鐘后保存于4°C。
[0017]引物對由上海生物工程有限公司合成，劃線部分分別為Nco I酶切位點和XhoI酶切位點。目的基因的瓊脂糖凝膠電泳分析圖如圖2所示，圖中M =Maker DL2000 ；1:紅鰭東方飩干擾素調節因子2基因的RT-PCR產物。
[0018]c.電泳回收RT-PCR產物與克隆載體pMD19T連接并轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5 α ,在含氨節青霉素的LB固體培養基上培養通過藍白斑法篩選陽性克隆,選擇957bp大小的條帶進行回收；
d.用限制性內切酶Nco I和Xho I分別雙酶切c步驟所回收的產物和表達載體pET-32a(+)，37°C作用2小時后，酶切產物用DNA膠回收試劑盒回收，pMD19T_TRF2質粒酶切產物和載體酶切產物按1:10的摩爾比混合，T4 DNA連接酶(Takara公司)16°C過夜連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a于37°C過夜培養。提取重組表達質粒pET32