具有神經保護作用的肽及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有神經保護作用的肽，尤其涉及一種具有改善ADDLs介導的神經毒性的肽，該肽可以用于制備防治阿爾茨海默病，屬于生物醫學技術領域。
【背景技術】
[0002]阿爾茨海默病(Alzheimer，sdisease, AD)，亦稱老年癡呆癥(senile dementia),是一種以進行性智能衰退為特征的中樞神經系統退行性疾病，其確切的發病機制尚不明確。近年來越來越多的研宄表明，可溶性β淀粉樣蛋白(amyloid|3-peptide, Αβ )寡聚物，也稱Αβ來源的可擴散性配體(Αβ-derived diffusible ligands, ADDLs)是AD病因的關鍵分子。目前，ADDLs已經成為治療AD的熱門靶點，靶向ADDLs治療不但可以改善AD的早期癥狀，而且還可能會延緩AD的進程。以ADDLs為靶點研宄改善認知功能障礙的治療策略會促進抗AD藥物的設計和開發，對于預防和早期治療AD具有重要的臨床意義和社會價值。
[0003]ADDLs攻擊神經細胞時，它們并不是各處都存在，而是選擇性地結合與學習和記憶相關的神經細胞受體。最近的研宄發現ADDLs可以和海馬神經元表面的受體酪氨酸激酶EphB2結合，這種結合導致EphB2的降解，進而削弱N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)正常功能的發揮。但內源的 ADDLs 和 EphB2在AD模型小鼠的海馬組織是否發生原位結合還有待研宄。
【發明內容】
[0004]發明目的:本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，本發明通過大量實驗研宄，篩選出ADDLs和EphB2的相互作用位點，優選出干擾二者相互作用的新型肽，本發明優選的肽可以結合ADDLs，從而可阻止ADDLs和EphB2的結合，阻止EphB2的降解，進而維持NMDAR在突觸膜上的表達，具有很好的改善ADDLs的神經毒性，改善突觸可塑性及認知功能，從而具有很好的神經保護作用，可用于制備防治阿爾茨海默病的藥物。
[0005]技術方案:為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為:
[0006]一種具有神經保護作用的肽，該肽具有下述的氨基酸序列:
[0007]Val-Phe-Gln-Val-Arg-Ala-Arg-Thr-Val-Ala (繳氛酸-苯丙氛酸-谷氛醜胺-結頁氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-丙氨酸)。本發明簡稱該肽為pep63，其氨基酸序列如序列I。
[0008]一種具有神經保護作用的肽，該肽具有下述的氨基酸序列:
[0009]Asn-Gly-Val-Thr-Asp-Gln-Ser-Pro—Phe-Ser (天冬醜胺-甘氛酸-繳氛酸-蘇氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸)。本發明簡稱該肽為P印32，其氨基酸序列如序列2。
[0010]本發明所述的以上二種具有神經保護作用的肽在制備防治阿爾茨海默病藥物中的應用。
[0011]本發明提供具有神經保護作用的肽，其中Pep63(氨基酸序列VFQVRARTVA)和P印32(氨基酸序列NGVTDQSPF S)，可以競爭性地結合ADDLs，阻止EphB2的降解，進而維持NMDAR在突觸膜上的表達，改善ADDLs的神經毒性，最終改善突觸可塑性及認知功能，從而具有神經保護作用和治療阿爾茨海默病的功效。
[0012]本發明提供的神經保護肽pep63和pep32可以用于制備改善ADDLs的神經毒性的制劑。
[0013]本發明通過免疫共沉淀實驗，證明內源的ADDLs和EphB2在AD模型小鼠的海馬組織中發生了原位結合。
[0014]本發明首先采用多肽陣列檢測的方法，詳細研宄了 ADDLs和EphB2的相互作用位點，根據ADDLs和EphB2的相互作用位點設計了 4種不同的干擾小肽。同時，本發明對設計的4種小肽進行了篩選。研宄證實上述的肽pep32和pep63能夠競爭性與ADDLs結合，從而阻止ADDLs和EphB2的結合，阻止EphB2的降解，進而維持NMDAR在突觸膜上的表達，改善ADDLs的神經毒性，具有很好的神經保護作用。
[0015]本發明的具有神經保護作用的肽在制備防治阿爾茨海默病藥物中的應用，根據中國藥典方法及其相關常用方法，把本發明具有神經保護作用的肽和藥學上可接受的載體制備成丸劑、膠囊劑、片劑或注射劑制劑。
[0016]有益效果:本發明和現有技術相比具有以下優點:
[0017]本發明通過大量實驗研宄篩選，優選得到特定氨基酸序列的肽，實驗結果表明本發明提供的肽pep32和pep63能夠競爭性與ADDLs結合，從而可有效阻止ADDLs和EphB2的結合，阻止EphB2的降解，進而維持NMDAR在突觸膜上的表達，改善ADDLs的神經毒性，從而具有很好的神經保護作用。采用本發明提供的肽可以用于制備神經元保護藥物，可以用來制備預防和/或治療阿爾茲海默病的藥物，在神經醫療領域有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0018]圖1是內源的ADDLs和EphB2在AD模型小鼠的海馬組織的結合。
[0019]圖2是ADDLs和EphB2相互作用位點的示意圖。
[0020]圖3是本發明提供的肽pep32和pep63對ADDLs和EphB2結合的抑制作用示意圖。
[0021]圖4是本發明提供的肽pep32和pep63對ADDLs神經毒性的改善作用示意圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。
[0023]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0024]其中，實驗試劑和所述肽購買情況如下:
[0025]Ant1-EphB2 (1:1000)購自R&D公司，Anti_GluN2B由浙江大學羅建紅惠贈，β-Actin 購自 Santa Cruz 公司。Ant1-BetaAmyloid 1-16 (6E10)購自 Covance 公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔以及山羊抗小鼠二抗購自碧云天生物技術有限公司，免疫共沉淀試劑盒購自Millipore公司，亞細胞提取試劑盒購自Calb1chem公司。HFIP以及DMSO購自Sigma公司。A IBp42購自Sigma公司。
[0026]采用SPSS 13.0軟件行統計學分析；實驗數據均數土標準差(mean土SD)表示；組內比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，兩組之間的比較采用t檢驗；p〈0.05，表示差異有統計學意義。
[0027]本發明實施例中采用免疫印跡(immunoblot ;IB)檢測蛋白的表達。按高燦等人已建立的方法(Gao C，et al., Hippocampus 2010;20:1072-1082)。樣品經 SDS-PAGE 分離后，以半干轉法/濕轉至PVDF膜上。轉移完畢后，加入封閉液，室溫封閉2h，一抗4°C過夜。TTBS洗膜，再和二抗于室溫下作用lh，曝光，顯影，定影，圖像經掃描，用Image J軟件進行分析。
[0028]本發明實施例中采用免疫共沉淀(immunoprecipitat1n ;IP)檢測蛋白質與蛋白質的相互作用。根據Millipore公司(Cat.17-500)的試劑盒說明操作。操作敘述如下:收集樣品總蛋白，裂解，離心取上清，加入相應抗體孵育，再與預處理好的protein A瓊脂糖珠孵育，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。免疫共沉淀反應之后，離心去上清，取沉淀物，加入SDS煮沸，然后走SDS-PAGE進行分離，用目的抗體進行蛋白檢測。
[0029]實施例1 AD小鼠模型中證實內源的ADDLs與EphB2之間的結合
[0030]有實驗已經證明合成的ADDLs被發現可以和成熟的海馬神經元的EphB2免疫共沉淀(Cisse,M.,Nature 469, 47-52.2011)，但內源的ADDLs和EphB2在AD模型小鼠的海馬組織是否發生原位結合還有待研宄。本發明通過大量實驗證明內源性ADDLs和EphB2在AD模型小鼠的海馬組織的結合。
[0031]具體實驗方法為:
[0032]1、樣品制備:將APP/PSN轉基因AD模型小鼠，斷頭，快速分離雙側海馬，置液氮中凍存備用。以下操作均在冰水浴中進行:從液氮中取出海馬加勻漿緩沖液，勻漿器高速勻漿(10sX6次)，于4°C 100g離心15min，小心移取上清液(主要為海馬的胞漿部分)，置-80 °C冰箱待用。
[0033]2、蛋白濃度測定:采用BCA微量法，以牛血清白蛋白(BSA，fract1n v )5mg/ml為標準蛋白。
[0034]3、免疫共沉淀:根據Millipore公司(Cat.17-500)的試劑盒說明操作:將以上收集的蛋白總樣品中，加入Αβ抗體(Ant1-6E10)孵育，再與預處理好的protein A瓊脂糖珠孵育，使Αβ抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。免疫共沉淀反應之后，離心去上清，取沉淀物，加入SDS煮沸，然后走SDS-PAGE進行分離，用EphB2抗體進行蛋白檢測。
[0035]檢測結果如圖1所示，結果證明在AD模型小鼠中ADDLs與EphB2可以發生結合。
[0036]實施例2 ADDLs和EphB2的相互作用位點的檢測
[0037]Cisse等人的工作揭示了 EphB2的FN結構域是其與ADDLs結合的關鍵區域(Cisse, M., Nature 469, 47-52.2011)，但是EphB2結合ADDLs的具體氨基酸序列還不清楚。本發明通過大量實驗，根據多肽陣列檢測試驗，鑒定出ADDLs與EphB2的FN結構域結合的具體氨基酸序列。
[0038]1、肽陣列合成
[0039]合成陣列蛋白信息如下:
[0040]PSAPQAVISSVNETSLMLEWTPPRDSGGREDLVYNIICKSCGSGRGACTRCGDNVQYAPRQLGLTEPRIYISDLLAHTQYTFEIQAVNGVTDQSPFSPQFASVNITTNQAAPSAVSIMHQVSRTVDSITLSWSQPDQPNGVILDYE
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