一種細胞膜蛋白質富集純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種細胞膜蛋白質富集純化方法。
【背景技術】
[0002] 細胞膜是細胞內外環境交流的界面，細胞膜蛋白質在細胞內外物質交換、細胞識 別與免疫應答信號傳導和調控，以及能量傳遞等方面扮演著重要的角色。在已知的藥物靶 標中，大約有70%是細胞膜蛋白質。因此，疾病細胞的過表達細胞膜蛋白質可作為治療用抗 體及小分子藥物的蛋白靶標。
[0003] 然而，目前在PDB數據庫中已經被成功解析的86000多種蛋白質的數據結構中，只 有1%~2%的結果與細胞膜蛋白質相關。原因在于細胞膜蛋白質具有豐度低、疏水性強及 大部分細胞膜蛋白質存在糖基化與磷酸化等翻譯后修飾造成膜蛋白的微觀不均一性的特 性。通過細胞膜與細胞器的分離及細胞膜蛋白質的富集，可以減少樣品的復雜性；同時可提 高起始樣品復合物的動力學范圍，從而提高低豐度蛋白的鑒定。因此，如何分離純化細胞膜 蛋白質特別是含有跨膜區的整合膜蛋白是細胞膜蛋白質組學研究的難點。
[0004] 近年來，研究者們利用細胞膜蛋白質的特性發展了許多細胞膜蛋白質的富集方 法，包括差速離心法、兩相分配法、抗體免疫磁珠結合法、生物素標記法等。然而，這些方法 具有膜細胞器污染嚴重、可用抗體種類少、回收率低等缺點。
[0005] 細胞表面蛋白糖基化修飾富集方法由于其應用范圍廣、純度高等優勢近年來受到 廣泛關注。（Wollscheid，B.，Bausch F.D.，Henderson C.，O'Brien R.，Bibel M.，Schiess R.，Aebersold R. &Watts, J. Nat. Biotechnol. 2009 (27)，378-386.)然而，目前采用該方法 研究細胞膜蛋白質的結果都關注于細胞膜蛋白質中的糖蛋白質及糖基化位點的研究，使用 該方法應用于細胞膜蛋白質的深度覆蓋的研究并未見報道。本發明集合了細胞表面糖基化 修飾蛋白質富集方法可高效完成細胞膜與細胞器分離的優勢及功能化磁性微球操作簡便、 分離快速、樣品損失低的特點，發展出一種細胞膜與細胞器分離高效、回收率高、操作簡便 的細胞膜蛋白質高純度富集方法。
【發明內容】
[0006] 為了克服細胞膜蛋白質提取純度低、膜細胞器污染嚴重等不足，本發明提供一種 細胞膜蛋白質富集純化方法，使用功能化磁性微球捕獲作為誘餌的細胞表面糖基化修飾蛋 白，以富集及分析細胞膜蛋白質，從而實現細胞膜與細胞器分離并獲得高純度細胞膜蛋白 質。該方法選擇性高，此外功能化磁性微球的使用，使該方法具有操作簡便，分離快速且樣 品損失小的優點。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0008] (1)細胞膜表面糖基化修飾蛋白的氧化：使用酶消化法、離子螯合法或物理法將培 養皿中細胞消化后，向細胞樣品中加入氧化緩沖液（pH為4-7的醋酸鹽與氯化鹽混合緩沖 液或磷酸緩沖液）配制的氧化劑(濃度為l-l〇〇mM的高碘化物）溶液與細胞反應5min-2h ;
[0009] (2)細胞膜表面糖蛋白的捕獲：采用氧化緩沖液清洗氧化的細胞樣品去除剩余的 氧化劑后，向細胞樣品中加入懸浮于氧化緩沖液的帶有功能化官能團的磁性微球，室溫下 震蕩2_24h ;
[0010] (3)醛基的封閉：采用pH為7-10的三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗捕獲蛋白樣品的 磁性微球，將捕獲細胞樣品的磁性微球重懸浮于三羥甲基氨基甲烷緩沖液并孵育5min-2h 以封閉經氧化的非細胞膜蛋白質；
[0011] (4)外周膜蛋白質的去除：分別使用0? 1-8M的氯化鈉、0? 1-8M氯化鉀溶液、0? 1-1M 的碳酸鈉溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的鹽酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氫銨溶液清洗磁 性微球以去除逸出的可溶性蛋白；
[0012] (5)細胞的裂解：向細胞樣品中加入裂解液，使用機械裂解、化學裂解或酶解方法 將細胞裂解；
[0013] (6)可溶性蛋白質的去除及細胞器分級：細胞裂解后，分別使用0. 1-8M的氯化 鈉、0. 1-8M氯化鉀溶液、0. 1-1M的碳酸鈉溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的鹽酸胍溶液或 10-1000mM的碳酸氫銨溶液清洗裂解的細胞樣品。
[0014] (7)細胞膜蛋白質的富集：向細胞樣品中加入pH為7. 5-14的堿性緩沖溶液(碳酸 氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液）配制的糖基肽酶溶液， 反應6-24h使連接在磁性微球上的糖鏈斷裂以獲得磁性微球上的細胞膜蛋白質；或使用pH 為7. 5-14的溶有體積濃度為1%-30%的表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP_40d)或去垢劑(尿素、硫脲或鹽酸胍）的堿性溶液超聲萃 取0. 1-2h獲得磁性微球上細胞膜蛋白質。
[0015] 本發明具有以下優點：
[0016] 1、可有效實現細胞膜與細胞器分離。功能化磁性微球僅與經氧化的細胞膜表面糖 基化修飾蛋白質反應，且在樣品處理過程中，加入多次清洗過程，去除逸出的細胞器及非細 胞膜蛋白質，實現細胞膜與細胞器的有效分離。
[0017] 2、細胞膜蛋白質純度高。保持細胞膜完整的條件下進行細胞膜表面糖基化修飾蛋 白質的捕獲；磁性微球捕獲細胞膜表面糖基化修飾蛋白質及細胞裂解后，使用三羥甲基氨 基甲烷緩沖液與樣品孵育，封閉非細胞膜蛋白質的醛基位點，阻止非細胞膜蛋白質與磁性 微球作用，減少細胞器蛋白質及可溶性蛋白質造成的污染；高鹽高pH緩沖液的使用，可有 效地去除細胞質蛋白及外周膜蛋白質。
[0018]3、操作簡便。功能化磁性微球的引入，可以通過磁力吸附實現磁性微球與非細胞 膜蛋白質的分離。
【附圖說明】
[0019] 圖1為細胞膜蛋白質富集純化流程圖。
[0020] 圖中1 :細胞膜表面糖蛋白的氧化2 :細胞膜表面糖基化修飾蛋白的捕獲3 :細胞 的裂解4 :細胞膜蛋白質的富集5 :細胞膜蛋白質的酶解6 :細胞膜蛋白質酶解產物的收集。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 1.細胞膜表面糖蛋白的氧化
[0023] 使用胰酶將培養皿中人宮頸癌細胞消化后，向細胞樣品中加入氧化緩沖液（100mM 醋酸鈉，150mM氯化鈉，pH5. 5)配制的5mM高碘酸鈉溶液與細胞反應lh ;
[0024] 2.細胞U吳表面糖蛋白質的捕獲
[0025] 采用氧化緩沖液清洗氧化的細胞樣品以去除剩余的氧化劑后，向氧化的細胞樣品 中加入懸浮于氧化緩沖液的酰肼磁性微球，室溫下震蕩16h ;
[0026] 3?醛基的封閉
[0027] 采用pH為8的100mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗捕獲蛋白樣品的磁性微球，并 將捕獲細胞樣品的磁性微球重懸浮于三羥甲基氨基甲烷緩沖液并孵育lh ;
[0028] 4.可溶性蛋白質的去除
[0029] 分別使用2M氯化鉀、4M尿素及2M氯化鈉溶液清洗磁性微球；
[0030] 5?細胞的裂解
[0031] 向細胞樣品中加入裂解液（pH為7. 4的磷酸緩沖液配制的2M氯化鈉溶 液，l%cocktail)，使用超聲破碎裂解細胞（10s on，10s off，300s);
[0032]