使用于木質纖維素材料的生物化學轉化的纖維素分解微生物失活的制作方法
【專利說明】利用CO2使用于木質纖維素材料的生物化學轉化的纖維素 分解微生物失活
[0001] 本發明涉及生產纖維素分解酶和半纖維素分解酶，尤其是在從纖維素或木質纖維 素材料生產乙醇的情況。 現有技術
[0002] 自二十世紀七十年代，在組分多糖被水解為可發酵糖之后，將木質纖維素材料轉 化為乙醇已經是大量研宄的焦點。可被引用的實例為來自國家再生能源實驗室的參考工 作（Process Design and Economics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol (木質纖維素生物質到乙醇的生物化學轉化的工藝設計及經濟學）， Humbird et al.，NREL1TP-5100-57764,2011 年 5 月）。
[0003] 木質纖維素材料為即包含大于90%重量纖維素的纖維素材料，和/或即由纖維 素，半纖維素和木質素構成的木質纖維素材料，所述纖維素和半纖維素為基本上由戊糖、己 糖和木質素構成的多糖，所述木質素為具有復雜結構和高分子量的大分子，由通過醚鍵鍵 合的芳醇組成。
[0004] 木材、稻草和玉米棒是最廣泛使用的木質纖維素材料，但是可以使用其它來源、專 用的森林栽培物、醇生成中的殘渣、糖和谷類植物、造紙業的產物和殘渣以及木質纖維素材 料的轉化產物。它們主要由約35% -50%的纖維素、20% -30%的半纖維素和15% -25%的 木質素構成。
[0005] 木質纖維素材料生物化學轉化為乙醇的方法包括：物理化學預處理步驟，接著利 用酶混合物（enzymatic cocktail)的酶水解步驟、釋放的糖的乙醇發酵步驟和純化乙醇的 步驟。
[0006] 乙醇發酵和酶水解，也稱為糖化作用，可以同時進行（同時糖化和發酵，或SSF)， 例如通過在水解步驟期間加入乙醇有機體。
[0007] 所述酶混合物是纖維素分解酶（也稱作纖維素酶）和/或半纖維素分解酶的混合 物。纖維素分解酶具有三種主要的活性類型：內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纖維二糖酶， 這些后者也被稱作β-葡糖苷酶。半纖維素分解酶尤其具有木聚糖酶活性。
[0008] 酶水解是高效的且在溫和條件下進行。相比之下，酶的成本仍然高，占木質纖維素 材料轉化為乙醇的成本的20%-50%。因為這個原因，進行了大量關于降低成本的研宄：通 過選擇超高生產力的微生物和通過改善生產所述酶的方法，然后降低水解中酶的量，通過 優化預處理步驟，通過改善這些酶的比活，和通過優化酶水解步驟的執行，來從最初優化酶 的生產。
[0009] 生產酶混合物的步驟包括三個主要階段：纖維素分解微生物生長階段（a);產生 酶混合物階段（b)以及分離和濃縮階段（C)，階段（c)期間酶混合物與纖維素分解微生物分 離并被濃縮。酶混合物與纖維素分解微生物的分離通過液/固分離（例如通過離心法）來 進行。通過過濾（例如通過超濾）濃縮所述酶混合物。
[0010] 這些分離階段是必需的，因為如果纖維素分解微生物被置于存在酶混合物和不存 在含碳底物下，存在纖維素分解微生物將消耗包含于所述混合物中的酶以使其可以存活， 從而導致生產損失的風險。
[0011] 另外，不考慮分離期間的處理，一部分酶混合物將總是隨包含微生物的級分而損 失。取決于采用的分離技術，這些損失可相當于分離前存在的酶混合物的3%重量-50%重 量。因此，使用沒有分離的醪液（mash)以防止這些損失可為有利的。
[0012] SSF步驟的操作溫度為約30°C -35°C。然而，這些溫度與纖維素分解微生物的生 長相容。因此，如果在SSF步驟中預期使用酶混合物而不分離纖維素分解微生物，則存在纖 維素分解微生物與用于發酵的酵母之間的競爭導致所述SSF步驟的產率降低的風險。事實 上，一部分通過水解釋放的葡萄糖將會被纖維素分解微生物消耗。
[0013] 因此，考慮到在SSF步驟中存儲和/或使用酶混合物和纖維素分解微生物，使纖維 素分解微生物失活以使分離酶混合物和所述纖維素分解微生物的步驟不再必需是有利的。 通過利用對于所述方法內在的手段，例如所述方法的一個步驟的產物，能夠使此微生物失 活也是有利的。
[0014] GB 1 489 145公開了從纖維素殘渣培養纖維素分解微生物和酶，以及使用培養基 /酶生產整體而沒有分離用于酶水解的任何組分。他們聲稱使用未經處理（過濾、濃縮或其 它）的"根據本發明"的培養基整體除了可調節PH，還能夠改善纖維素水解的速率和產率。
[0015] 該專利未提及酶水解條件下纖維素分解微生物里氏木霉（T.reesei)的生長的 潛在問題，也未提及通過纖維素分解微生物的蛋白再消耗的潛在問題。事實上，相比于 在30°C -35°C范圍的溫度下進行的SSF，酶水解通常在阻止纖維素分解微生物生長的溫度 (45°C和55°C之間）下進行。
[0016] Barta等人（"軟木基乙醇植物對于不同碳源的原位纖維素酶生產的工藝設計及 經濟學（Process Design and Economics of On-Site Cellulase Production on Various Carbon Sources in a Softwood-Based Ethanol Plant)"， Enzyme Research，2010 卷， doi :10. 4061/20 10/734182)公開了將含有纖維素分解微生物的全部培養基加入至SSF 步驟。根據該作者，這沒有引起問題，由于SSF在37°C下進行，而當溫度超過35°C時纖維 素分解微生物的生長被完全抑制。該假設是可疑的，因為已知木霉屬（例如擬康氏木霉 (T. pseudokoningii)，土孢木霉（T. saturnisporum))的某些種能夠在高達40°C _41°C下發 展。
[0017] 然而，本申請人的研宄已經導致這樣的發現，即對于生物質到乙醇的生物化學轉 化方法是內在的某些流可用于使纖維素分解微生物失活。
[0018] 本發明提出一種使纖維素分解微生物失活的方法，該方法克服了迄今出現的缺 點。
[0019] 發明概述和優點
[0020] 在通過與包含少于0. 5摩爾％的氧氣的氣體流接觸使纖維素分解微生物失活中， 無需將所述微生物與產生的酶混合物分離，所述氣體流對于生物質到乙醇的生物化學轉化 方法中是內在的。
[0021] 所用內在氣體流的明智選擇意味著可以避免對所述方法性能的任何負面影響，所 述負面影響可由通過再循環效應而積累不需要的物類引起。
[0022] 因此本發明方法的一個優點是產生的酶混合物的損失是受限的。另一個優點是設 備的尺寸是受限的：通過限制損失，來限制補償所述損失所需的過量生產。另一優點是在酶 混合物/纖維素分解微生物分離期間通過使清洗階段減至最少或甚至將其省去來限制排 放。另一優點是通過限制或甚至省去酶混合物/纖維素分解微生物分離階段來使污染風險 最小化。
[0023] 將在下文中以非窮舉方式列出的本發明方法的優點意味著能夠降低從木質纖維 素材料生產乙醇的成本，改善本領域的競爭地位。
[0024] 發明詳述
[0025] 本發明涉及一種使能夠生產酶混合物（cocktail)的纖維素分解微生物失活的方 法，所述混合物在木質纖維素材料的生物化學轉化過程中使用而沒有分離纖維素分解微生 物，所述方法包括至少一個使氣體流與包含所述微生物的培養基接觸的步驟，所述氣體流 包含大于25%重量的CO 2并包含小于0. 5摩爾％的0 2。
[0026] 優選地，所述氣體流源自SSF步驟。
[0027] 優選地，在接觸步驟前，所述氣體流經過處理以將其乙醇和揮發性有機化合物含 量降低至少25%。
[0028] 優選地，所述處理是用水洗滌所述氣體流。
[0029] 優選地，所述接觸步驟在SSF步驟中進行。
[0030] 優選地，所述接觸步驟在酶混合物生產步驟中在生產所述混合物階段的結束時進 行。
[0031] 優選地，所述接觸步驟在酶混合物生產步驟和SSF步驟之間進行。
[0032] 優選地，所述纖維素分解微生物選自屬于木霉屬、曲霉屬、青霉菌屬或裂褶菌屬的 真菌菌株。
[0033] 優選地，所述纖維素分解微生物屬于里氏木霉種。
[0034] 酶混合物生產步驟利用纖維素分解微生物，所述生產過程在浸沒培養中進行。術 語"浸沒培養"是指在液體培養基中的培養。
[0035] 用于生產酶混合物的方法中的纖維素分解微生物為屬于木霉屬、曲霉屬、青霉菌 屬或裂裙菌屬，優選屬于里氏木霉種的真菌菌株。表現最好的工業菌株為屬于里氏木霉種 的菌株，該菌株通過突變選擇過程被修飾以改善酶混合物，例如菌株IFP CL847 (法國專利 FR-B-2 555 803)。也可以使用通過基因重組技術改善的菌株。在與其生長及酶的產生相 容的條件下，在攪拌通氣反應器中培養這些菌株。
[0036] 根據本發明，包含小于0. 5摩爾