靶向治療的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2012年6月25日提交的美國臨時申請 No. 61/663, 679的優先權，以引用的方式將其內容整體并入本文。
技術領域
[0003] 概括地說，本發明涉及通過將活性劑（active agent)(例如治療劑（therapeutic agent))綴合、融合、或非直接連接（non-direct linkage)至一個或多個肝素結合肽 (heparin-binding peptide, HB)來遞送所述活性劑的方法和組合物。其它方面涉及包含 與治療劑融合或綴合的肝素結合肽（HB)的組合物、方法和試劑盒。
【背景技術】
[0004] 治療劑（例如重組細胞因子和小分子）的全身給藥或非特異性活性可觸發脫靶后 遺癥（selequae)。因此，仍需要將活性分子靶向遞送至感興趣的位點。
【發明內容】
[0005] 本實施方式提供了將重組治療蛋白或小分子選擇性遞送至表達蛋白聚糖 (proteoglycans)的細胞或組織，所述細胞或組織例如但不限于軟骨、腦和脊髓組織、皮膚 和皮下組織。更具體而言，本文的一些實施方式針對任選通過接頭肽（linker peptide)融 合至治療蛋白或其部分的新型肝素結合肽（HB)。一些實施方式提供了小分子與新型HB的 綴合或間接連接以用于選擇性遞送。HB-試劑組合物可串聯（in tandem)使用，以將治療蛋 白和試劑遞送至組織。
[0006] 本發明的一個方面提供了包含例如（HB-接頭）n-Xm_(接頭-HB)。的選擇性治療組 合物，其中，HB為肝素結合蛋白，X為活性劑（例如治療蛋白或其部分、或治療小分子），以 及其中，n、m和〇為整數,并且m至少為1、且n+o至少為1。在一些實施方式中，HB-X綴合 物為HB-X n* (HB-接頭）n-Xn，其中，η是至少為1的整數。在一些實施方式中，該組合物為 包含重組HB和治療蛋白（或其部分）的重組融合蛋白。相對于所述組合物的HB部分的 N末端，該組合物的組件（components)可以按順序安放：HB-X、X-HB、HB-接頭-X、（ΗΒ-接 頭）2-X、X-接頭-HB、X-HB-X、HB n-X-HBn、（HB-接頭）n-X-(接頭-HB)n、HB-X-HB-X 等。另外， 該組合物可包含HB-K構建體（constructs)的混合物，其中，X代表不同的蛋白或不同的小 分子（即，含有HB-X 1和HB-X 2等的組合物）。示例接頭為含有氨基酸GGG的肽。包括本領 域公知的其它接頭（例如已知的肽接頭和化學接頭），以供HB-X綴合物使用。
[0007] 更具體而言，組合物的HB部分憑借HB肽中的多個賴氨酸殘基和精氨酸殘基而帶 正電荷，所述組合物的HB部分結合至細胞或組織表達的蛋白聚糖，所述蛋白聚糖通過硫 酸根（sulfate)基團而帶負電荷。在【具體實施方式】中，通過用精氨酸殘基或賴氨酸殘基 替換天然半胱氨酸殘基來使HB突變，以增強正電荷。例如，HB可選自具有如下氨基酸殘 基序列的肽或其功能性變體、類似物或衍生物：KRKKKGKGLGKKRDPCLRK YK(SEQ ID N0:1); KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQIDN0:2)(也稱為HBC16R);或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO :3)(也稱為 HB C16K)。
[0008] 此外，可任選用聯接（connecting) HB肽的接頭肽使組合物的HB部分重復。因此， 例如，使用SEQ ID NO :2作為示例性HB部分，治療分子可包含下列氨基酸、或者可連接至 下列氨基酸：KRKKKGKGLG KKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID N0:4)或 KRKK KGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLR KYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO ： 5)。包括本領域普通技術人員公知的接頭肽（例如，如本文所公開的接頭肽），以供本發明 使用。在一些實施方式中，接頭肽包含GGG。在一些實施方式中，接頭肽包含（GGGGS) (SEQ ID NO :42)。
[0009] 在一些實施方式中，重組HB融合蛋白的活性劑可選自：神經營養因子，包括神經 營養蛋白（Neurothrophins)，例如神經生長因子（NGF)、腦源性神經營養因子（BDNF)、神經 營養蛋白-3(1^111'〇壯〇?11111-3，階'-3)、神經營養蛋白-4(階'-4)、睫狀神經營養因子化階^)、 中腦星形膠質細胞源性（astrocyte-derived)神經營養因子（MANF)或保守性多巴胺神經 營養因子（conserved dopamine neurotrophic factor，CDNF);神經膠質細胞系源性神經 營養因子家方矣配體（Glial cell-line derived neurotrophic factor family ligands), 例如神經膠質細胞系源性神經營養因子（⑶NF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)或 persephin (PSPN);促神經生長細胞因子（Neuropoietic cytokines),例如白介素-6、白 介素-11、白介素-27、白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor)、睫狀神經營 養因子、心臟營養素 l(cardiotrophin 1)、神經生成素（neuropoietin)、心臟營養素樣 細胞因子（cardiotrophin-like cytokine)或成纖維細胞生長因子2;抗炎細胞因子， 包括白介素-4和白介素-10 ;神經保護劑（Neuroprotection agents),包括神經調節蛋 白-I(Neuregulin-I)和血管內皮生長因子（VEGF);或其它治療蛋白，例如Cerebrolysin? (FPF-1070)、生長分化因子11(⑶F11)、基質細胞衍生因子l(Stromal cell-derived factor 1，SDF-1)、肌肉生長抑制素（Myostatin)(生長分化因子8(⑶F8));胰島素樣生長 因子I(IGF-I);甲狀旁腺激素（PTH);甲狀旁腺激素相關肽（PTHrP);白介素1受體拮抗 劑（IL-IRA) ;IL-1/IL-1RA嵌合體（chimerias)、成纖維細胞生長因子18 (FGF-18);高遷 移率族蛋白2(High-mobility group protein 2, HMG-2,也被稱為高遷移率族盒2(High mobility group box 2, HMGB2));治療抗體或其部分，例如REMICADE? (英夫利昔 單抗（infliximab)，抗 TNF-a，Janssen Biotech，Horsham, Ι)Λ)、HUMIRA? (阿達 木單抗（adalimumab)，抗 TNF，Abbot Labs.，N. Chicago，IL)、ENBREL? (依那西普 (etanercept)，重組抗TNF蛋白，Amgen ,Thousand Oaks ,CA)、或抗神經生長因子抗體；成纖 維細胞生長因子9(FGF-9);肝細胞生長因子；TGFP超家族蛋白，例如TGF0、TGF0 3、BMP2 或BMP7 ;血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)、生長抑素（somatostatin，SST)，或任何這些活性 劑的功能部分、變體、類似物或衍生物。
[0010] 在一些實施方式中，HB融合體（fusion)的治療蛋白部分選自：IGF-l、PTH、PTHrP、 IL-1RA、FGF-18,或它們的功能部分、類似物或衍生物。
[0011] 本發明的另一個方面提供了治療軟骨相關臨床病癥（例如損傷或疾病）的方法， 所述方法包括向受試者給予有效量的含有HB-X的重組融合蛋白，其中，X為治療蛋白或其 部分，其中，所述治療蛋白選自：IGF-1、PTH、PTHrP、IL-1RA、FGF-18、抗神經生長因子抗體、 FGF-9、肝細胞生長因子、TGF β、TGF β 3、BMP2、BMP7，或它們的功能部分、類似物或衍生物。
[0012] 在另一個【具體實施方式】中，HB融合至糖皮質激素（Glucocorticoid)受體，這有利 于將皮質類固醇（corticosteroids)祀向遞送至軟骨；所述融合至糖皮質激素受體的HB的 給藥可與皮質類固醇的給藥同時（concurrently)進行或單獨（separately)進行。
[0013] 在一些實施方式中，軟骨病癥為關節軟骨缺陷（articular cartilage defect) (包括破裂（rupture)或脫離（detachment))、半月板缺陷（包括部分撕裂（tear)或 完全撕裂）、骨關節炎（Osteoarthritis)、外傷性軟骨破裂或脫離、強直性脊柱炎、囊炎 (Capsulitis)、銀屑病關節炎（Psoriatic arthritis)、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、 或X-連鎖低血磷性拘僂病（X-linked hypophosphatemic rickets)、或幼年特發性關節炎 (Juvenile idiopathic arthritis)。軟骨病癥的治療可與其它療法聯用，作為用于關節軟 骨修復、半月板修復或韌帶修復的其它外科干預的輔助，以同時改善修復并防止骨關節炎 的發展。
[0014] 本發明的另一個方面提供了治療神經性（neurological)病癥（例如障礙 (disorder)或疾病），所述治療神經性病癥包括向受試者給予有效量的含有HB-X的重組 融合蛋白，其中，X為治療蛋白或其部分，所述治療蛋白選自：神經生長因子（NGF)、腦源 性神經營養因子（BDNF)、神經營養蛋白-3 (NT3)、神經營養蛋白-4 (NT-4)、睫狀神經營養 因子（CNTF)、中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（MNF)、保守性多巴胺神經營養因子 (O)NF)、神經膠質細胞系源性神經營養因子（⑶NF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、 persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫狀神經營養因 子、心臟營養素1、神經生成素、心臟營養素樣細胞因子、FPF-1070、成纖維細胞生長因子2、 神經調節蛋白-1、血管內皮生長因子（VEGF)、IGF或胰島素樣生長因子I (IGF-I)。
[0015] 所述神經性病癥可選自：阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化 癥（Amyotrophic lateral sclerosis)、多發性硬化癥（Multiple sclerosis)、腦損傷 (Brain injury)、脊髓損傷、周圍神經變性（Peripheral nerve degeneration)、中風、亨廷 頓氏病、皮克氏病（Pick' s disease)、糖尿病性神經病變（Diabetic neuropathy)、額顳 癡呆（Frontotemporal dementia)、路易體癡呆（Dementia with Lewy bodies)、皮質基底 節變性（Corticobasal degeneration)、進行性核上性麻搏（Progressive supranuclear palsy)、朊病毒障礙、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、遺傳性痙攣性下肢輕癱（Hereditary spastic paraparesis)、脊髓小腦萎縮（Spinocerebellar atrophies)、弗里德希氏共濟失 調（Friedreich，s ataxia)、淀粉樣變性或 Charcot Marie Tooth 綜合征（Charcot Marie Tooth syndrome)〇
[0016] 另一個實施方式提供了用于治療眼病的HB-X組合物的給藥，所述眼病例 如為角膜潰瘍、角膜磨損、Thygeson淺層點狀角膜病變（Thygeson' s superficial punctate keratopathy)、角膜血管新生（Corneal neovascularization)、富克斯營 養不良（Fuchs' dystrophy)、干燥性角結膜炎（Keratoconjunctivitis sicca)、脈絡 膜視網膜炎癥（Chorioretinal inf lammation)、脈絡膜視網膜瘢痕（Chorioretinal scars)、脈絡膜變性（Choroidal degeneration)、遺傳性脈絡膜營養不良（Hereditary choroidal dystrophy)、視網膜脫離、視網膜劈裂（Retinoschisis)、高血壓性視網膜病變 (Hypertensive retinopathy)、早產兒視網膜病變（Retinopathy of prematurity)、年齡 相關性黃斑變性（Age-related macular degeneration)、視網膜變性、黃斑變性、黃斑視 網膜前膜（Epiretinal membrane)、周邊視網膜變性、遺傳性視網膜營養不良（Hereditary retinal dystrophy)、色素性視網膜炎（Retinitis pigmentosa)、干眼癥（Xerophthalmia) 或視網膜出血（Retinal haemorrhage)。
[0017] 本發明的另一個方面提供了治療炎癥的方法，所述方法包括向受試者給予有效量 的含有HB-X的重組融合蛋白的方法，其中，X為治療蛋白或其部分，所述治療蛋白選自：TNF 受體2、白介素-4或白介素-10。
[0018] 在本發明的另一個實施方式中，在持續釋放（sustained release)載體（例如透 明質酸）中提供HB-X，以延長HB-X組合物的釋放和生理作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1提供了示出關節內（intra-articular)注射后一個實施方式的HB-IGF-I的 長期保留（retention)的數據。在關節內注射IGF-1、HB-IGF-I或PBS之一后2、4、6和8 天時，對大鼠關節軟骨、半月板或館腱（patellar tendon)中保留的IGF-I或HB-IGF-I進 行蛋白印跡分析。
[0020] 圖2示出關節內注射后IGF-I與HB-IGF-I的血清水平。將雄性Lewis大鼠 2 5l_275g(Charles River, Wilmington MA)隨機分配至 3 組中的 1 組（每組 η = 3): HB-IGF-1、IGF-I或鹽水。大鼠在右膝關節接受50 μ 1關節內注射，各自含有IOOyg HB-IGF-UlOOyg IGF-I或鹽水。在注射后2、4、8、24、48和96小時時經由尾靜脈收集血 液。用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，麗）對血清水平進行測量。在前三個時間點時， 血清中的HB-IGF-I水平顯著低于IGF-I水平。2小時后，HB-IGF-I水平沒有顯著不同于鹽 水。這表明相比未關聯HB的IGF1，HB-IGF-I的關節內注射限制了非特異性IGF-I循環的 量。
[0021] 圖3為描繪在大鼠中關節內注射后由HB-IGF-I引起的對軟骨生物合成和增殖的 離體（ex vivo)持續性（sustained)刺激的柱狀圖。大鼠在右膝關節接受單次50 μ 1關節 內注射，各自含有IOOyg -個實施方式的HB-IGF-IUOOyg IGF-I或PBS。注射后2天和 4天時處死大鼠，收集半月板并在有放射性標記的情況下進行培養。圖表表示關節內注射后 2天和4天時半月板中[ 35S]硫酸根（sulfate)的摻入。結果以平均值土SEM顯示。
[0022] 圖4是來自比較HB-IGF-I、IGF-I和PBS的OARSI評分的骨關節炎研究的柱狀圖。
[0023] 圖5示出了可溶性HB-IGF-I的優異表達，所述可溶性HB-IGF-I包含增強的 HB(eHB)肽：C17K(SEQ ID N0:22)和 C17R(SEQ ID N0:21)。圖 5 示出了在用不同 HB-IGF-I 融合變體孵育軟骨分離體（explants)后使用抗IGF-I抗體檢測IGF-I的存在的蛋白印跡， 其中，所述 HB 變體包含 C17K(SEQ ID N0:22)、C17R(SEQ ID N0:21)、C17S(SEQ ID N0:41) 和野生型 HB(SEQ ID N0:20)。圖 5 表明，相比 C17S(SEQ ID N0:41)和野生型 HB(SEQ ID N0:1)的 HB 變體，包含 C17K(SEQ ID N0:22)或 C17R(SEQ ID N0:21)變體的 IGF-I 融合蛋 白在軟骨中獲得了更高的IGF-I保留。
[0024] 圖6示出了以包含C17R(SEQ ID N0:21)HB變體的HB-IGF-I融合蛋白進行的可溶 性HB-IGF-I純化的優異產率。圖6示出了使用抗IGF-I抗體對由通過尺寸排阻色譜法純 化的軟骨提取物進行的蛋白印跡，以檢測用含有C17R(SEQ ID N0:21)HB肽或野生型HB(SEQ ID NO :20)HB肽的HB-IGF-I融合變體孵育軟骨分離體后的IGF-I的產率。圖6示出了相 比HB (WT)-IGF-I融合蛋白，來自用HB (C17R)-IGF-I融合蛋白C17R孵育的提取物的IGF-I 具有顯著較高的產率。
[0025] 圖7示出了 HB(C17R)使得由包涵體獲得了優異的HB-IGF-I產率。圖7示出了使 用抗IGF-I抗體對由包涵體純化的軟骨提取物進行的蛋白印跡，以檢測用含有C17R(SEQ ID NO :21)(稱為eHB) HB肽或野生型HB (SEQ ID NO :20) HB肽的HB-IGF-I融合變體孵育軟骨 分離體后的IGF-I的產率。圖7示出了相比用HB(WT)-IGF-I (wHB-IGF-1)融合蛋白孵育的 提取物，由HB(C17R)-IGF-l(eHB-IGF-l)融合蛋白獲得的誘導包涵體和未誘導包涵體中的 IGF-I具有顯著較高的產率。
[0026] 圖8示出了用HB-IGF-I孵育的脊髓中IGF-I的保留的蛋白印跡。將大鼠脊髓組 織在無添加（無 IGF-1)、含1 μ g/ml IGF-I或1 μ g/ml HB-IGF-I的培養基中孵育24小時。 孵育后，對組織進行洗滌，并立即冷凍（"第〇天"）或在收集清洗的蛋白前在新鮮培養基中 孵育另外的24小時（"第1天"）。然后，用抗IGF-I抗體通過蛋白印跡對組織進行分析， 以檢測殘留在脊髓組織中的IGF-I或HB-IGF-I的