在原核細胞周質中產生多肽的方法

在原核細胞周質中產生多肽的方法
【專利說明】在原核細胞周質中產生多肽的方法
[0001] 本文報道了在原核細胞中產生多肽的方法，其中使用存在螯合劑的緩沖系統中的 孵育步驟，在確定PH值和溫度值下，從原核細胞周質中回收重組產生的多肽。
【背景技術】
[0002] 具有合適的信號序列時，重組產生的多肽可以被分泌到大腸桿菌細胞的周質間 隙中（J〇ly，J.C.和 Laird, M.W·，Periplasm 編著，Ehrmann，M. ,ASM 印制，Washington D. C.，（2007)345-360)。在化學氧化環境中二硫鍵形成，由此有利于多肽在功能上的正確折 疊。這些多肽從周質間隙中的選擇性分離是所希望的，以避免來自大腸桿菌的宿主細胞蛋 白（HCP)的污染。由此，有利于隨后的多肽純化。
[0003] 示例性分離方法是如 Ren, G.等，J. of Bacteriology 189 (2007) 2777-2786 所描 述的滲壓沖擊。使用該方法，溶解于TRIS緩沖液（pH為7. 2)中的EDTA使原核細胞外膜去 穩定，這使得蔗糖滲透到周質間隙。蔗糖是不能透過內膜的。之后通過離心除去TRIS-EDTA 緩沖液中，將細胞迅速重懸于冰冷的蒸餾水中。由此水浸入充滿蔗糖的周質間隙，通過周質 體積的增加使不穩定的外膜崩解。添加氯化鎂重新穩定外膜。
[0004] 可以在 Humphreys, D. P. (The Periplasm(編著）Ehrmann，M.，第 361-388 頁，Washington, D.C. :ASM 印制（2007))和 Middelberg，A. P. (Biotechnol. Adv. 13(1995)491-551)中找到其他方法。
[0005] 根據Joly和LaircK見上文），"當培養體積達到或高于10升時，以小規模分離周 質級分（fraction)的常規方法（如原生質體或滲壓沖擊處理）實際上不能完成"。"從外 部介質回收蛋白或在僅破壞外膜和肽聚糖后回收蛋白仍然是尚未在大規模上付諸實踐的 一個目標"（第354頁）。
[0006] 在W02012/013930中報道了，從表達重組蛋白和二硫化物異構酶DsbC的革蘭氏陰 性細菌宿主細胞的樣品或提取物純化重組蛋白，包括調節樣品或提取物的PH值以沉淀和 分離DsbC。在W001/94585中報道了特異于人腫瘤壞死因子（TNF)-a的新型抗體對于治 療TNF-α介導的疾病是有用的，例如，充血性心力衰竭、敗血癥或內毒素性休克、惡病質和 成人呼吸窘迫綜合癥。在美國2005/048056中報道了制備具有重鏈和輕鏈的腫瘤壞死因 子-α抗體，包括發酵細胞混合物、形成細胞沉淀、并允許沉淀持續放置一段時間。
[0007] 在WO 2007/106120中報道了調節肽分子組織，分布包括向組織施用包含血清白 蛋白結合肽的綴合物分子。在W001/45746中報道了對免疫球蛋白（Ig)G、IgM和/或人血清 白蛋白具有親和性的肽配體可被綴合，并用于延長活性劑從循環中清除的半衰期。在美國 2004/001827中報道了調節肽分子的組織分布，用于增強治療功效并減少副作用，其包括向 組織施用包含肽的配體結構域和活性結構域的綴合物分子。

【發明內容】

[0008] 在本發明中已經發現，通過在室溫下使細胞接觸pH值約為8的含有緩沖劑（如 Tris)和螯合劑（如EDTA)的溶液、或孵育細胞與pH值約為8的含有緩沖劑（如Tris)和 螯合劑（如EDTA)的溶液，可以從原核細胞的周質中分離重組產生的多肽。該方法能夠在 大規模生產過程中以高產率和純度分離重組產生的多肽。分離的多肽對下游處理（例如純 化）顯示出良好的可行性。
[0009] 如本文中所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在溶液中孵育 原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的緩沖劑和約0. 5mM 至約9. 5mM的螯合劑，所述溶液的pH值約7至約10。
[0010] 在一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺、次氮基三乙酸（NTA)、乙二醇四乙酸 (EGTA)、二亞乙基三胺五乙酸（DTPA)、1，2-雙（鄰-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N'_四乙酸 (BAPTA)、乙二胺-N，Ν' -二琥珀酸（EDDS)、膦酸鹽（如乙二胺四（亞甲基膦酸）EDTMP或二 亞乙基五（亞甲基膦酸）DTPMP)、檸檬酸、卩卜啉類化合物（如血紅素、葉綠素或維生素 Β12)。 在一個實施方案中，螯合劑是乙二胺四乙酸（EDTA)。
[0011] 如本文所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在約25°C在溶液 中孵育（重懸）原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的 Tris-HCl和約2mM至約6mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0012] 如本文所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在約25°C在溶液 中孵育（重懸）原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的 Tris-HCl和約2mM至約4mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0013] 在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約ImM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑 的濃度為約ImM至約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約ImM至約3mM。在一個實 施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至 約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為 約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約6mM。
[0014] 在一個實施方案中，EDTA的濃度為約0. 5mM至9. 5mM。在一個實施方案中，EDTA 的濃度為約ImM至約3mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約2mM。在一個實施方案中， EDTA的濃度為約4mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約6mM。
[0015] 在一個實施方案中，本發明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約2mM。
[0016] 在一個實施方案中，本發明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約4mM。
[0017] 在一個實施方案中，本發明所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約6mM。
[0018] 在一個實施方案中，溶液具有約7. 5至約8. 5的pH值。在一個實施例中，本發明 所報道的方法的特征在于，PH值約為8。
[0019] 在一個實施方案中，孵育時間為約20分鐘至約3. 5小時。在一個實施例中，本發 明所報道的方法的特征在于，孵育時間是約30分鐘。
[0020] 在一個實施方案中，緩沖劑是與原核細胞外膜相互作用的物質。
[0021] 在一個實施方案中，緩沖劑是一價有機胺。在一個實施方案中，緩沖劑是三（羥甲 基）氨基甲烷（Tris)或其鹽。
[0022] 在一個實施方案中，緩沖劑選自磷酸或其鹽、嗎啉或其鹽（MOPS)、3_{[三（羥甲 基）甲基]氨基}丙磺酸（TAPS)、N，N-雙（2-羥乙基）甘氨酸（Bicine)、N-三（羥甲基） 甲基甘氨酸（Tricine)、3-[N-三（羥甲基）甲基氨基]-2-羥基丙磺酸（TAPSO)、4-2_羥乙 基-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)、2-{[三（羥甲基）甲基]氨基}乙磺酸（TES)、組氨酸或其鹽、甘 氨酸或其鹽，或三（羥甲基）氨基甲烷（Tris)或其鹽。在一個實施方案中，鹽是Tris-HCl。
[0023] 在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約IOmM至約95mM。在一個實施方案中， Tris-HCl的濃度為約15mM至約50mM。在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約20mM至 約60mM。在一個實施例中，本發明所報道的方法的特征在于！Tris-HCl的濃度為約20mM。 在一個實施方案中，本發明所報道的方法的特征在于：Tris-HCl的濃度為約40mM。在一個 實施方案中，本發明所報道的方法的特征在于：Tris-HCl的濃度為約60mM。
[0024] 在一個實施方案中，在室溫下進行該方法。在一個實施方案中，在20°C至33°C下 進行如本文所報道的方法。在一個實施方案中，在約25°C下進行如本文所報道的方法。
[0025] 在一個實施方案中，用于產生多肽的方法包括在約25°C在溶液中孵育（重懸）原 核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約IOmM至約95mM的Tris-HCl和約2mM 的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。
[0026] 在一個實施例中，本發明所報道的方法的特征在于，所述原核細胞是革蘭氏陰性 細胞。
[0027] 在一個實施方案中，所述原核細胞是重懸細胞。
[0028] 在一個實施方案中，所述原核細胞選自具有外膜的革蘭氏陰性細菌。在一個 實施方案中，所述原核細胞選自醋桿菌屬（Acetobacter)、擬桿菌屬（Bacteroides)、 疏螺旋體（Borrelia)、Bortadella、伯克霍爾德桿菌屬（Burkholderia)、彎曲桿菌 屬（Campylobacter)、衣原體屬（Chlamydia)、梓檬酸細菌屬（Citrobacter)、腸桿菌 屬（Enterobacter)、埃希氏菌屬（Escherichia)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、幽門螺 桿菌屬（Helicobacter)、嗜血桿菌屬（Hemophilus)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、軍團 菌屬（Legionella)、鉤端螺旋體屬（Leptospiria)、奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、硝化 桿菌屬（Nitrobacter)、變形菌屬（Proteus)、假單胞桿菌屬（Pseudomonas)、立克次氏 體屬（Rickettsia)、沙門氏菌屬（Salmonella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、志賀氏菌屬 (Shigella)、硫桿菌屬（Thiobacter)、密螺旋體屬（Treponema)、弧菌屬（Vibrio)、黃單胞 菌屬（Xanthomonas)或耶爾森氏菌屬（Yersinia)。在一個實施例中，本發明所報道的方法 的特征在于，所述原核細胞是大腸桿菌細胞。
[0029] 在一個實施方案中，多肽是非糖基化多肽。
[0030] 在一個實施方案中，多肽是抗體或抗體片段。在一個實施方案中，抗體片段選自 Fv、Fab、Fab'、Fab' _SH、F(ab'）2;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);和由抗體 片段形成的多特異性抗體。
[0031] 在一個實施例中，本發明所報道的方法中使用的溶液基本上不含肽聚糖水解酶。 在一個實施方案中，肽聚糖水解酶選自溶菌酶（胞壁酸酶）、裂解的轉糖基酶、N-乙酰 基-β -D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶或