一種miR-10b基因在胃癌基因表達調控中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種HiiR-IOb基因在癌癥中的作用，具體涉及在胃癌中的應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤的侵襲轉移能力是腫瘤治療的一大難點。近些年來，微小 RNA(micr〇RNA，miRNA)的出現為研究腫瘤的發生及侵襲轉移機制提供了新的思路和途徑， 微小RNA(miRNA)是一類內源性、保守、穩定的非編碼短單鏈RNA，在轉錄后水平調節靶基因 表達miRNA在機體發育、細胞增殖、凋亡及腫瘤發生發展等生理和病理過程中發揮重要作 用，成為當前生命科學研究的熱點。miRNA (microRNA)是廣泛存在于生物體內的19-25nt的 非編碼單鏈小分子RNA，其通過與靶基因 mRNA的互補配對降解靶mRNA或抑制其翻譯。研 究表明miRNA在腫瘤發生過程中起重要作用，miRNA很有可能成為癌癥治療與診斷的新途 徑。miRNA與靶基因 mRNA的非編碼序列（3^ -UTR或Y -UTR)存在著一對多的關系。在 癌癥病例中經常發現miRNA群表達失調的現象，而這些miRNA表達的改變與癌癥發生密切 相關。在體外實驗中，改變一個或者多個miRNA的表達能夠促進或者抑制癌細胞惡化，促進 癌細胞惡化的miRNA可以認為是一類癌基因，反之，抑癌基因。miR-lOb作為微小RNA家族 中的一員，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質瘤、垂體瘤、急性髓性白血病等腫瘤組織中都有異 常表達，并且與腫瘤的侵襲性和遠處轉移有密切關系。
[0003] 胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，胃癌發病有明顯的地域性差別，在我國的西 北與東部沿海地區胃癌發病率比南方地區明顯為高。好發年齡在50歲以上，男女發病率 之比為2 :1。胃癌的預后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學行為以及治療措施有 關。據世界衛生組織估計，2008年全球范圍內大約100萬胃癌新發病例，占全部腫瘤發病 的7. 8%，僅次于肺癌、乳腺癌和結直腸癌。超過70%的胃癌病例發生在發展中國家，其中 50%發生在中國。在我國，胃癌年齡標化發病率男性為41. 3/10萬，女性為18. 5/10萬，僅 次于肺癌。大約90%-95%的胃癌為腺癌,起源于胃部上皮組織。已有文獻報道miR-lOb 在多種癌中起到抑癌基因的作用。KLF4(Kriippel-like factor4)是一種在多種人類組織 中廣泛表達的鋅指轉錄因子，在許多不同的生理活動中具有重要作用，研究表明KLF4基因 與多種腫瘤的發生發展有關，通過檢測癌組織中KLF4蛋白的表達，探討KLF4蛋白與胃癌臨 床病理間的關系。
[0004] 本發明擬在胃癌細胞中驗證KLF4是否是miR-lOb的靶基因，并探討miR-lOb在胃 癌侵襲轉移中的調控機制，為胃癌的臨床治療提供理論依據。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了克服現有技術中上述缺陷，提供一種miR-lOb基因作為KLF4 靶基因的調控者在制備下調胃癌細胞中KLF4表達水平藥物中的應用。具體地，調節癌癥細 胞中KLF4表達水平為miRNA-lOb抑制KLF4的表達，其中癌癥細胞主要為胃癌細胞，并且 其中所述miR-lOb在RNA和蛋白水平同時調節靶基因 KLF4的表達。本發明還提供了一種 KLF4作為癌癥治療靶點在制備治療癌癥藥物中的用途，其中癌癥細胞主要為胃癌細胞。
[0006] 本發明還提供了以下具體方法，研究KLF4是否是miR-lOb的靶基因，具體為：
[0007] a)生物信息學方法對miR-lOb的靶基因進行預測；
[0008] b)不同胃癌細胞中miR-10b、KLF4mRNA表達水平的相關性檢測；
[0009] c)熒光素酶報告驗證KLF4是miR-lOb的靶基因；
[0010] d)建立穩定表達miR-lOb的細胞株，熒光定量PCR技術和western blot技術闡明 miR-lOb作用于靶基因 KLF4的核酸水平或蛋白水平；
[0011] e)胃癌組織中驗證miR-lOb和KLF4的表達相關性。
[0012] 本發明培養多種胃癌細胞株，收集細胞進行總RNA抽提后，采用熒光定量PCR法檢 測不同細胞中miR-lOb，KLF4mRNA的表達水平。發現miR-lOb與KLF4mRNA表達呈相反趨勢 后，采用雙熒光素酶檢測法進一步驗證KLF4是miR-lOb的直接靶基因。進一步采用熒光定 量PCR，WesternBlot檢測上調miR-lOb的表達對靶基因 KLF4核酸和/或蛋白表達水平的 調控方式。最后在臨床胃癌組織樣本中分析miR-lOb和KLF4表達的相關性。
[0013] 胃癌細胞中HiiR-IOb的表達水平影響細胞的增殖，遷移能力等，在胃癌的發生起 重要的作用。KLF4與癌癥的發生密切相關。miR-lOb通過與其靶基因 KLF4的mRNA的 3' -UTR互補，抑制靶基因 mRNA的翻譯或直接降解靶mRNA。本實驗通過軟件預測、構建載 體，然后在胃癌細胞中利用熒光素酶報告基因分析驗證了 KLF4是miR-lOb的靶基因，并在 AGS細胞中利用qRT-PCR技術，進一步驗證了該發現。所公開的為在AGS細胞系中KLF4是 miR-lOb的靶基因的首次報道，該發明為利用miRNA-lOb為胃癌提供藥物靶點方面提供了 一定的應用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1.不同胃癌細胞中miR-lOb表達水平的檢測；
[0015] 圖 2. pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro 質粒構建圖譜；
[0016] 圖 3. PCR 驗證 pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro，擴增 RFP 序列。
[0017] 1?6 :挑取的克隆；7 :陰性對照；
[0018] 圖 4. EcoRI/BamHI 雙酶切驗證 pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro，
[0019] I :未酶切質粒對照；2 :EcoRI/BamHI雙酶切的質粒；
[0020] 圖 5. pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro 質粒構建圖譜；
[0021] 圖6. PCR驗證miR-lOb表達載體，1?12 :挑取的克隆，13 :陰性對照；
[0022] 圖 7. EcoRI/BamHI 雙酶切驗證 pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro 載體，
[0023] 1 :未酶切質粒；2 :EcoRI/BamHI酶切質粒；
[0024] 圖8.慢病毒包裝示意圖；
[0025] 圖9.過表達和抑制表達miR-lOb后穩轉細胞株中miR-lOb的表達水平；
[0026] 圖10.過表達miR-lOb后，KLF4mRNA和蛋白表達水平的檢測；
[0027] 圖11.熒光素酶報告檢測。
[0028] 圖12. miR-lOb在胃癌組織中的表達分布。
[0029] 圖13. KLF4蛋白在胃癌組織中的定位和表達。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例進一步描述本發明。
[0031] 實施例一：不同胃癌細胞中miR-10b，KLF4mRNA表達水平的檢測
[0032] 培養多種胃癌細胞株，收集細胞進行總RNA抽提后，采用熒光定量PCR法檢測不同 細胞中miR-10b，KLF4mRNA的表達水平。
[0033] 結果可見，miR-lOb與KLF4mRNA表達在不同的胃癌細胞中呈相反趨勢，miR-lOb在 SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803 依次下降，而在 SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS， MGC-803中呈上升趨勢，提示KLF4可能是miR-lOb的靶基因（圖1)。
[0034] 實施例二：慢病毒缺失表達載體pO)H-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro和過表 達載體pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro的構建以及KLF4靶基因細胞學觀察
[0035] 本實驗設計miR-lOb干擾載體，基于慢病毒表達載體
[0036] pCDH-CMV