轉基因元件及其應用、區分雄性不育系和可育保持系的方法、擴繁玉米雄性不育系的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業技術領域，特別涉及一種轉基因元件及其應用、區分玉米雜交種 母本雄性不育系和保持系的方法、一種擴繁玉米雜交種母本雄性不育系的方法。
【背景技術】
[0002] 玉米是全世界總產量最高的糧食作物，我國是僅次于美國的第二大玉米生產國， 2012年，我國玉米產量超過水稻，成為我國第一大糧食作物。玉米還是重要的口糧、飼料糧、 工業原料和能源原料，在國民生產中有舉足輕重的地位。
[0003] 玉米種植主要以雜交種為主，雜交種遺傳了雙親的顯性有利基因，其抗病、抗蟲、 抗干旱等環境適應能力明顯增加，產量和品質相應提高。隨著玉米種植面積的逐年增加， 玉米雜交種的需求量也逐漸增大。但是目前雜交種的制種過程卻是一項十分繁重的工作， 它需要將母本去雄，用父本的花粉給母本自然授粉，一旦去雄不徹底，就會影響雜交種的質 量。
[0004] 目前，雜交種母本的去雄主要是人工來完成的。在隔離區內，將父本與母本間隔種 植，并且在散粉前將母本的雄穗人工拔除，用父本的花粉給母本自然授粉，結的種子就上生 產上所用的F 1代雜交種。
[0005] 在實際生產過程中，由于受到環境的影響，去雄后的母本可能會再生出雄穗，或者 人工去雄不徹底，都會導致雜交種中混雜母本自交系的種子，影響到雜交種的純度，造成生 產上的巨大損失。
[0006] 當制種量較大、手工操作滿足不了需求時，也可采用機械去雄。機械去雄速度快， 成本低，但是對植株造成的傷害大，且與手工去雄一樣存在著去雄不徹底的缺陷。因此，尋 找新的技術，既可以降低生產成本，又能達到徹底去雄的目的，生產出低成本高質量的玉米 雜交種，已成為目前育種行業迫切追尋的目標。
[0007] 研究表明，通過科學有效的方法來控制玉米的育性，從而達到高效制種的目的是 可行的。玉米雄性不育系的利用為這一目標的實現提供了保證。細胞質雄性不育系的引入 可避免制種過程中繁重的去雄過程，降低種子生產成本，保證種子的純度。由于細胞質因子 的影響，細胞質雄性不育系是雄性不育的，它可以利用恢復系的花粉完成授粉過程并產生 匕代雜交種。但是有的細胞質雄性不育系容易感病，這一因素限制了細胞質雄性不育系在 玉米雜交種生產過程中的廣泛應用。
[0008] 美國專利US4654465和US4727219公布了另一種類型的遺傳不育性，但是這種遺 傳不育性需要基因組中不同位點的多個基因同時突變才能形成，并且每代還要用大量的分 子標記對這些基因進行追蹤，其復雜性限制了在玉米制種過程中的廣泛應用。Patterson提 出了染色體移位系統，但是操作也比較復雜（見美國專利US3861709和US3710511)。近年 來，科研人員一直試圖優化雄性不育制種體系。
[0009] 在美國專利US5478369中描述了一種更完善的雄性不育系統，該系統首先沉默一 個參與調控雄性生育能力的關鍵基因，同時導入該基因與啟動該基因表達的誘導型啟動 子，從而達到人為調控植株雄性生育能力的目的。這樣的植株正常情況下是組成型不育的， 只有當啟動子被誘導、所調控的雄性生育基因表達后植株才具有生育能力。
[0010] 有些情況下，當控制雄性不育的核基因純合隱性時，植株會表現出雄性不育。但 是，雄性不育植株自身無法繁殖后代，只有通過與雜合植株雜交或通過轉基因的方式將正 常基因導入不育株后才能結實，但得到的種子無法區分是純合不育的還是雜合狀態的，所 以不便于我們直接的利用。這一問題可以通過不含有恢復基因的花粉來解決，即提供一個 保持系，它產生的花粉不含有恢復基因，當用它的花粉給不育系授粉時，所產生的后代仍然 為純合隱性不育系。Dellaporta等人的美國專利（US6743968)中就描述了一種方法，該方 法將顯性恢復基因、花粉特異性啟動子啟動的花粉致死基因構建在一個載體上，然后通過 轉基因技術一起轉入雄性不育植株，轉基因后代恢復育性，但是產生的花粉中只有不含恢 復基因的有活性，所以當它給純合隱性雄性不育植株授粉時，它們的后代為純合隱性不育 植株。
[0011] 隨著玉米轉基因技術和分子生物學技術的日益成熟，人為的創建具有形態標記的 雄性不育系及保持系已經成為可能。中國農業大學（CN102960234A)將育性恢復基因和控 制籽粒大小基因的RNA干擾片段通過轉基因技術一起導入玉米，然后通過回交轉育分別構 建了同一材料的雄性不育系（含有隱性純合的雄性不育突變基因）和保持系（既含有隱 性純合的雄性不育基因又含有雜合的包含育性恢復基因和控制籽粒大小基因 RNA干擾片 段的轉化元件），該方法通過籽粒形狀區分不育系和保持系，其中形狀正常的種子為不育系 (不含轉基因序列），形狀異常（籽粒變小）的種子為保持系。但是，隨著玉米播種季節與 生長環境的不同，也會產生籽粒形狀與大小的差異，不利于大批量的機械化區分，且區分的 準確度也相應下降。因此，利用此性狀作為籽粒標記在生產應用上存在一定的局限性。
[0012] 因此，提供一種利用轉基因元件擴繁玉米雜交種母本雄性不育系的方法具有重要 的現實意義。
【發明內容】
[0013] 有鑒于此，本發明提供一種轉基因元件及其應用、區分玉米雜交種母本雄性不育 系和保持系的方法、一種擴繁玉米雜交種母本雄性不育系的方法。該方法利用細胞核雄性 不育基因、控制籽粒胚乳淀粉合成關鍵基因的RNA干擾片段、分子標記輔助選擇技術和轉 基因技術用于擴繁玉米雜交種母本雄性不育系并應用于雜交種生產。
[0014] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0015] 本發明提供了一種轉基因元件，包括：
[0016] ( I )第一表達框，所述第一表達框含有玉米雄性不育基因的顯性等位基因和所 述顯性等位基因的啟動子；
[0017] ( II )第二表達框，所述第二表達框含有甜質基因的啟動子、所述甜質基因的正向 RNAi片段、所述甜質基因的反向RNAi片段。
[0018] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述玉米雄性不育基因的顯性等 位基因：
[0019] ⑴具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0020] (ii)具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列75%同源性的序列；
[0021] (iii)具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0022] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述玉米雄性不育基因的顯性等 位基因的啟動子：
[0023] (i)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0024] (ii)具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列75%同源性的序列；
[0025] (iii)具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0026] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述甜質基因為Bt2。
[0027] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述甜質基因的啟動子：
[0028] (i)具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
[0029] (ii)具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列75%同源性的序列；
[0030] (iii)具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0031] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述甜質基因的正向RNAi片段：
[0032] (i)具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0033] (ii)具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列75%同源性的序列；
[0034] (iii)具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0035] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述甜質基因的反向RNAi片段：
[0036] (i)具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0037] (ii)具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列75%同源性的序列；
[0038] (iii)具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷 酸獲得的核苷酸序列。
[0039] 在本發明的一些具體實施方案中，轉基因元件中所述第二表達框還包括所述甜質 基因的內含子。
[0040] 本發明還提供了上述轉基因元件在玉米雜交種制種中的應用。
[0041] 在本發明的一些具體實施方案中，上述轉基因元件在玉米雜交種制種中的應用包 括區分玉米雜交種母本雄性不育系和保持系、擴繁玉米雜交種母本純合隱性雄性不育系。 [0042] 本發明