一種根癌農桿菌介導的亞麻芥遺傳轉化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物生物技術領域，尤其是一種根癌農桿菌介導的亞麻芥遺傳轉化方 法。
【背景技術】
[0002] 亞麻芥（Camelina sativa(L. )Crantz)屬于十字花科，具有抗旱、抗寒、耐瘠、 耐鹽堿、抗病蟲害等優良特性，是一種低投入的油料作物。亞麻芥油中亞油酸含量為16%? 18 %，亞麻酸含量為36 %?40 %，天然維生素 E含量為42?48mg/100g，多不飽和脂肪酸總 含量超過60 %，不飽和脂肪酸總含量超過90 %。因此，亞麻芥油以其天然保健、化學穩定等 優點，被廣泛應用于高檔保健油、食品添加劑、醫藥、化妝品等許多領域。
[0003] 同時，隨著化石能源消耗對全球政治、經濟及環境所帶來的負面效應的顯現，化石 燃料的價格波動，政治動蕩導致的供應不可靠，溫室氣體排放等因素，尋找開發清潔可替代 的可再生能源已成為緊迫任務。由于亞麻芥低成本、高收益、安全性高被廣泛關注，隨著對 其油脂及油脂甲酯理化性質和用其生產生物柴油可行性分析研究的不斷深入，亞麻芥被認 定為發展潛力巨大的新興生物燃油作物。燃料特性很大程度上取決于制備生物燃油原料的 脂肪酸組成，生物燃料要求更高的抗氧化能力、穩定性和燃燒特性，以高含單不飽和脂肪酸 油酸為較理想成分。為解決原料匱乏問題，全世界范圍內都在積極尋找適合各地區氣候與 生態條件的柴油植物品種，因此，通過遺傳轉化的方法對亞麻芥的遺傳特性進行修飾，對于 獲得高產量、高油酸含量、燃料特性好的亞麻芥品種具有重要的現實意義，將有力推動我國 在利用油料植物作為經濟有效能源的研究和開發。
[0004] 在植物遺傳轉化中，比較傳統的侵染方法包括：把地上部分直接侵入農桿菌懸浮 液中進行侵染和用微量取液器吸取農桿菌懸浮液直接滴在花蕾上進行侵染。這兩種方法轉 化效率低，且在浸染過程中易造成污染。目前，關于亞麻芥的遺傳轉化體系的建立鮮有報 道，因此，構建程序簡單、轉化效率高、重復性好的亞麻芥遺傳轉化體系仍是亞麻芥遺傳改 良中亟需解決的問題。
[0005] 通過專利檢索，尚未發現與本發明申請專利相關的專利公開文獻。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服傳統的亞麻芥遺傳轉化技術的不足，在傳統浸染的基礎 上，采用真空浸染轉化裝置，使用普通儀器，構建程序簡單、轉化效率高、重復性好的亞麻芥 遺傳轉化體系，提供一種以亞麻芥花序為轉化受體，通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法， 把外源基因導入到亞麻芥受體細胞中，經過篩選再生，獲得亞麻芥轉基因植株。
[0007] 本發明實現目的的技術方案是：
[0008] -種根癌農桿菌介導的亞麻芥遺傳轉化方法，所述方法是將預培育的開花初期的 亞麻芥花序浸入含有目的基因和篩選基因質粒的根癌農桿菌菌液中，具體步驟如下：
[0009] ⑴工程菌株的構建與鑒定：采用CaClJi制備根癌農桿菌感受態細胞，平均分裝數 管，24h內直接用于轉化或液氮速凍后-80°C保存待用；將含有標記基因的載體質粒導入根 癌農桿菌感受態細胞中，每管中按根癌農桿菌感受態細胞=YEB液體培養基的體積比為1 :8 的比例加入YEB液體培養基，混勻后置于28°C環境中復蘇2h ;4000?5000r/min室溫下離 心45s，除去大部分上清液，取少部分上清液重懸菌體，少部分上清液與每管根癌農桿菌感 受態細胞的體積比為1 :1，將重懸菌體涂布到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB 固體抗性平板培養基上；28°C倒置培養24-48h，在YEB固體抗性平板培養基上得到抗性菌 落；
[0010] 從YEB固體抗性平板培養基上隨機挑取新鮮培養的根癌農桿菌菌株的陽性單菌 落，接種到含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB液體培養基中，28°C，180r/min 振蕩培養過夜；堿裂法提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，酶切鑒定重組質粒，取鑒定轉化 成功的根癌農桿菌單菌落待用；
[0011] ⑵待轉化亞麻芥苗的準備：將蛭石、營養土、珍珠巖混合，該混合物要保證透氣性 和土壤的營養，均勻播撒亞麻芥種子，覆膜2-3d以緩苗，保持在20/16°C (白天/夜晚）自 然光照種植培育，當亞麻芥植株20%以下的花序處于完全開放、60%以上處于含苞時期時 用于轉化；
[0012] ⑶真空滲透介質的制備：挑取鑒定轉化成功的根癌農桿菌單菌落接種于含50mg/ L利福平的YEB液體培養基中，28°C培養過夜得菌液；將菌液轉接到體積為菌液本身100 倍的上述YEB液體培養基中，28°C、180r/min持續振蕩培養24-48h，4000-6000r/min離心 lOmin，棄上清，用上述YEB液體培養基：無菌滲透培養基的體積比為I :40-60的比例的無 菌滲透培養基懸浮菌體，混合均勻，即制備得到轉化植株的滲透介質，待用；
[0013] ⑷浸染與共培養：亞麻芥開花初期，把植株放入一個高于300mm的干燥器中，連 接一真空泵，使亞麻芥花序倒置浸沒于盛有上述滲透介質的干燥器中，真空泵抽真空保持 85kPa轉化5min ;然后，用保鮮袋套住亞麻芥花序，置黑暗條件下共培養24-48h，去袋，恢復 在20/16°C (白天/夜晚）自然光照培育，直到種莢成熟，收獲Ttl代種子；
[0014] (5)轉基因種子或植株的初篩：利用載體質粒所含有的標記基因對亞麻芥Ttl代種子 或播種T tl代種子而培育的T i代植株進行初篩；
[0015] (6)轉基因植株的鑒定：培育T1代植株，以初篩陽性的植株葉片為材料，提取植株 DNA，針對標記基因或目的基因設計引物，采用PCR法鑒定是否可擴增出目的基因片段，若 鑒定成功，即得到亞麻芥轉基因植株。
[0016] 而且，所述步驟⑴中載體質粒為具有卡那霉素抗性的pBGl 100,該質粒含有Bar抗 草丁膦除草劑標記基因。
[0017] 而且，所述步驟(5)、(6)的具體步驟如下：
[0018] (5)轉基因種子或植株的初篩：載體質粒pBinGlyBarl中含有Bar抗草丁膦除草劑 標記基因，當植株生長到兩葉期、莖長3cm時，將草丁膦除草劑與水以體積比為1:300的比 例混合得混合溶液，使用此混合溶液噴灑!\代亞麻芥幼苗；噴灑除草劑一周之內，大部分植 株由葉片開始卷曲、干枯直至整株死亡，極少數植株仍可正常存活，取可正常存活的植株， 即完成對轉基因植株的初步篩選；
[0019] (6)轉基因植株的鑒定：培育T1代植株，以初篩陽性的植株葉片為材料，提取植株模 板DNA，針對標記基因 Bar基因設計引物序列1/序列2進行PCR鑒定，轉基因株系中能夠擴 增出420bp的目的片段，即得到亞麻芥轉基因植株。
[0020] 而且，所述步驟⑵中蛭石、營養土、珍珠巖按質量比為2:2:1比例混合；
[0021] 或者，所述YEB固體抗性平板培養基的每L組成為：1. Og/L酵母膏+5. Og/L牛肉 膏 +5. Og/L 蛋白胨 +0· 5g/L MgS04+5. Og/L 鹿糖 +15g/L 瓊脂 +50mg/L 利福平 +50mg/L 卡那 霉素 ，pH 7· 0-7. 4。
[0022] 而且，所述YEB固體抗性平板培養基的制備如下：將各組份混合后，pH調至 7. 0-7. 4,121°C滅菌20min，待培養基溫度降至60°C時，再添加利福平和卡那霉素，混勻倒 平板待用。
[0023] 而且，所述步驟⑶中無菌滲透培養基組成為：1/2MS培養基+糖的水溶液5% (占 該培養基總質量的質量百分數）+高效有機硅表面活性劑〇. 05% (占該培養基總體積的體 積百分數），PH 5.7。
[0024] 而且，所述糖的水溶液中糖為葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖或乳糖。
[0025] 而且，所述無菌滲透培養基的制備如下：1/2MS培養基+糖的水溶液5% (占該培 養基總質量的質量百分數），PH調至5. 7,經過121 °C滅菌20min，溫度降至常溫后，再添加 高效有機硅表面活性劑，混勻后的培養液用于懸浮菌體。
[0026] 而且，所述步驟(5)的具體步驟如下：若載體質粒中含有DSRed紅色熒光蛋白標記 基因，則采用綠色Led光透過紅色太陽鏡片照射Ttl代種子，肉眼分辨呈紅色熒光的即為轉 基因 Ttl代種子；若載體質粒中含有Bar抗草丁膦除草劑標記基因，則可通過對T 植株噴 灑草丁膦除草劑，能夠正常生長的初步判定為轉基因植株，由此進行初篩；或者，選擇其他 的標記基因，根據載體質粒所含的標記基因的不同選擇不同的篩選方法。
[0027] 而且，所述根癌農桿菌為根癌農桿菌菌株EHA105。
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