黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDH1及其編碼蛋白與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種黃花蒿冰片脫氫酶基因 AaBDHl及 其編碼蛋白與應用。
【背景技術】
[0002] 黃花蒿（Artemisia annua L.)又名臭蒿，為菊科（Asteraceae)蒿屬（Artemisia) 植物，黃花蒿葉中含有豐富的冰片和樟腦等單萜類化合物。冰片是傳統中藥，中醫認為冰片 味辛苦、微寒，歸心、脾、肺經，有開竅醒神、通諸竅等作用。《本草綱目》記載，冰片具有"通諸 竅、散郁火"之功效。在許多中成藥中常作為"藥引"，以增加其它藥物的治療效果，即中醫 所謂的"芳香走竄，引藥上行"、"獨行則勢弱，佐使則有功"。冰片具有通諸竅、去郁火、去翳 明目、消腫止痛的功能，還具有抗菌、抗炎、抗生育、抗心絞痛等作用，還發現具有抗癌活性 等藥理作用，并對中樞神經系統能夠增加血腦屏障的通透性，因此，冰片在醫藥制劑上的作 用越來越重要。冰片可抑制或殺滅金黃色葡萄球菌、乙型溶菌性鏈球菌等5種常見細菌，其 最低抑菌濃度（MIC)為1. 0% -2. 0%，最低殺菌濃度（MBC)為1. 5% -2. 0%。小鼠耳廓腫 脹和大鼠足跖腫脹的抑制實驗中，表明龍腦和異龍腦均能顯著抑制蛋清所致的大鼠足跖腫 脹。冰片具有促進其它藥物透皮吸收的作用，能促進曲安縮松透皮吸收。冰片有利于冠脈 痙攣的防治，可減輕缺血所致的心肌損傷。樟腦是冰片的氧化產物，樟腦具有通關竅、利滯 氣、辟穢濁、殺蟲止癢、消腫止痛的功效，主治疥癬瘙癢、跌打傷痛、牙痛等癥狀。樟腦涂于皮 膚有溫和的刺激及防腐作用。用力涂擦有發赤作用；輕涂則類似薄荷，有清涼感，此乃由于 刺激冷覺感受器的作用。它還有輕度的局部麻醉作用。對于胃腸道粘膜，樟腦有刺激作用， 使胃部感到溫暖及舒適，大量則能產生惡心及嘔吐。臨床上用樟腦擦劑有鎮痛、止癢作用。 口服有驅風作用以及輕微的祛痰作用。樟腦的全身作用主要是興奮中樞神經系統，對于高 級中樞尤為顯著，大量作用于大腦皮層運動區及腦干，引起癲癇樣驚厥。一般劑量的樟腦對 呼吸無明顯作用，在極度抑制情況下，可看到一些呼吸的興奮，主要是由于皮下注射時刺激 感受器所引起的反射性興奮。樟腦制劑曾一度廣泛匝用為強心藥，但各家報告結果很不一 致，迄無定論。它無洋地黃或腎上腺素樣作用，對正常心肌無作用，高濃度反抑制之。在離 體心臟上，只有在造成衰竭時，方見有興奮作用。對血管運動中極，只有在其機能極度低下 時，方見有興奮作用，內臟血管收縮而皮膚血管舒張，血壓上升。故認為對循環性虛脫或急 性心功能衰竭者有效。隨著現代藥理研究的不斷深入，冰片和樟腦的新的藥理功能不斷被 發現，具有廣闊的應用前景。然而，冰片轉化為樟腦的分子機制尚未明確，尤其是黃花蒿中 冰片冰片脫氫酶及其基因尚未報道。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種黃花蒿冰片脫氫酶基因 AaBDHl，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0004] 本發明的另一目的在于提供上述冰片脫氫酶基因 AaBDHl編碼的蛋白，該蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0005] 本發明的冰片脫氫酶基因 AaBDHl是從黃花蒿（Artemisia annua L.)中克隆得到 的一種新的冰片脫氫酶基因（現將該基因命名為AaBDHl)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，該基因全長為1415bp，分析表明，該序列包含一個完整的編碼區885bp，5'非翻譯區 (UTR)315bp，3'非翻譯區180bp和polyA尾巴35bp，編碼294個氨基酸組成的蛋白（冰片 脫氫酶）。由該基因編碼的冰片脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該蛋白的分子 量為分子量31043. 4Da，理論等電點PI 6. 16,含量較豐富的氨基酸：Val (36個，12. 3% )、 Gly(30 個，占 10. 2% )、Ala(24 個、8. 2 % )、Leu(24 個、8. 2 % )、Ser(22 個，占 7. 5 % )、 Asn (21個，占7. 1 % )、Thr (18個，占6. 1 % )，含量比較少的氨基酸是Gln (4個，占1. 4% ) 和皿6以5個，占1.7%)，而不含1'印、？71和5〇6。帶負電荷的氨基酸數仏8?+6111)為28，帶 正電荷的氨基酸數（Arg+Lys)為25,分子式為C1370H2196N3740424S11原子總數為4375， 其半衰期在體外哺乳動物網織紅細胞內為30h，在酵母細胞內大于20h，在大腸桿菌細胞內 大于IOh,不穩定系數為15. 6,表明該蛋白穩定性好。脂肪系數為98.06, Grand average of hydr〇pahicity(GRAVY)親水性評估為-0. 142。為便于表述，將該冰片脫氫酶命名為 AaBDHl。
[0006] 應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員 可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。因而，本發明冰片脫氫酶基因還包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼AaBDHl的核 苷酸序列。
[0007] 此外，應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的冰片脫氫酶的氨基酸序列 (SEQ ID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到 所述蛋白的突變序列。因此，本發明冰片脫氫酶還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經取 代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與AaBDHl同等活性的由AaBDHl衍生得到的蛋 白質。
[0008] 本發明的又一目的是提供含有冰片脫氫酶基因 AaBDHl的重組表達載體 pET28a(+)-AaBDHl 和基因沉默載體 pHe 11 sgate8-AaBDHl。
[0009] 將本發明的AaBDHl基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明蛋白的 重組表達載體或抑制本發明基因表達的基因沉默載體，進一步將該重組表達載體或者基因 沉默載體導入適當的宿主細胞中，獲得表達本發明AaBDHl的基因工程菌，或者轉基因黃花 蒿或組織。
[0010] 在本發明實例中，根據AaBDHl編碼區序列設計包含酶切位點的引物，通過RT-PCR 的方法先克隆到T-easy載體上，測序正確后將AaBDHl克隆到原核表達載體pET28的多克 隆位點，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，進行誘導表達，優化條件，獲得具有活性的冰片脫氫酶。 實驗表明，AaBDHl能夠催化冰片形成樟腦。
[0011] 在本發明實例中，根據AaBDHl全長序列設計引物，擴增AaBDHl全長序列中的 300bp-550bp左右的基因片段，通過BP反應連接到pD0NR221構建中間載體，測序正確后將 中間載體與pHellsgate 8通過LR反應獲得AaBDHl基因沉默載體pHellsgate8_AaBDHl， 轉化農桿菌農桿菌LBA4404,浸染黃花蒿葉片等外植體，獲得轉基因黃花蒿或組織，其體內 AaBDHl表達水平得以改變，從而調控冰片與樟腦的比例。
[0012] 本發明首次提供了一種冰片脫氫酶基因 AaBDHl序列，其編碼蛋白其能夠催化冰 片形成樟腦，為體外催化冰片生成樟腦，以及黃花蒿體內調控香精油組分的組成（冰片與 樟腦的比例）提供了一種新的可選擇途徑。此外，本發明通過原核表達制備重組AaBDHl，克 服了直接從黃花蒿中分離該蛋白的困難，降低了成本。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明候選差異基因的半定量RT-PCR分析圖。
[0014] 其中，A :18S rRNA ;B :Mutl ;C :Mut2 ;D :Mut3 ;E :Mut4 ;F :Mut5 ;G :Mut6 ;H ;Mut7 ; I :Mut8 J :Mut9 ;K :MutlO ;W :野生型黃花蒿，M :冰片富集型突變株黃花蒿。
[0015] 圖2是本發明PCR產物凝膠電泳圖。
[0016] 其中，A :5, -RACE，B :3, -RACE。
[0017] 圖3是黃花蒿與其它植物脫氫酶蛋白的氨基酸同源性比較。
[0018] 圖4是AaBDHl基因的PCR產物電泳圖。
[0019] 其中，P :PCR 產物，M :Marker。
[0020] 圖5是AaBDHl基因異源表達載體電泳圖。
[0021] 其中，M :Maker，第1-5泳道：菌落PCR產物；第6-10泳道：純化質粒。
[0022] 圖6是AaBDHl異源表達產物SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 其中，1 :純化蛋白；2 :粗蛋白，3 :Marker。
[0024] 圖7是重組蛋白的酶實驗。
[0025] 其中，A = NADP+酶反應產物；B:NAD+酶反應產物；C :2_茨醇標樣色譜圖；D :樟腦標 樣色譜圖。
【具體實施方式】
[0026] 以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0027] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0028] 實施例1、定量蛋白組學分離冰片脫氫酶基因片段
[0029] 從長沙市采集到一株冰片富集型突變體黃花蒿，其葉中冰片的含量（0.85mg/g， DW)約為野生型的15倍，而沒有檢測到樟腦的存在，而在野生型黃花蒿中含有較高量的樟 腦（0.72mg/g，DW)而冰片的含量卻很低。對于其他化合物，在野生型和突變體之間的濃度 沒有顯著差異。研究還發現在野生型黃花蒿的莖中含有〇. 218mg/g(DW)的樟腦和0. 017mg/ g的冰片，而突變體莖含有〇. 28mg/g(DW)的冰片，無樟腦存在。突變體材料的獲得為冰片 脫氫酶基因的克隆奠定了堅實基礎。以此突變體黃花蒿為材料，通過定量蛋白組學技術 (iTRAQ)分離差異蛋白。具體方法為：取黃花蒿芽頭2g，在液氮中冷凍3min，研磨成細粉末， 將樣品轉移到EP管中，懸浮于4°C預冷的含有Tris-HCl (50mM，pH為8.0)、1 % SDS和5mM EDTA的裂解緩沖液中，渦旋后在3000rmp下離心15min，將上清液轉移到新EP管中，并在 12000rmp下進一步離心30min，將上清液再次轉移到新的EP管中，并濃縮，加入6BV-20°C 預冷的丙酮，在-20°C下溫育2. 5h，并在3000rmp離心IOmin,去丙酮。將沉淀重新懸浮在 0.5M含有0.1