除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，特別是涉及一種對2, 4-D 具有抗性的蛋白質、其編碼基因及用途。
【背景技術】
[0002] 雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其它目的植物所需要的有價值的養分。目前有許 多類型的除草劑用于控制雜草，一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經開發了對草甘膦具 有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麥和水稻等。因此可以對種植草甘膦抗性作物 的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害作物。
[0003] 草甘膦已經在全球廣泛使用超過20年，由此導致對草甘膦和草甘膦耐性作物技 術的過度依賴，并在野生雜草物種中對草甘膦天然更具耐受性或已經發展出抗草甘膦活性 的植物施加了高選擇壓。已報道有少數雜草已發展出對草甘膦的抗性，包括闊葉雜草和禾 本科雜草，如瑞士黑麥草、多花黑麥草、牛筋草、豚草、小飛蓬、野塘蒿和長葉車前。此外，在 廣泛使用草甘膦耐性作物之前并不是農業問題的雜草也逐漸盛行，并且難于用草甘膦耐性 作物控制，這些雜草主要與（但不僅與）難于控制的闊葉雜草一起出現，如莧屬、藜屬、蒲公 英屬和鴨跖草科物種。
[0004] 在草甘膦抗性雜草或難于控制的雜草物種的地區，種植者可以通過罐混或換用能 控制遺漏雜草的其它除草劑來彌補草甘膦的弱點。在多數情況下控制闊葉雜草的一種流行 且有效的罐混伴侶為2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)。2, 4-D已經在農業和非作物條件下用 于廣譜闊葉雜草控制超過65年，仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對進一步使用2, 4-D 的限制在于它在雙子葉植物（如大豆或棉花）中的選擇性非常低，因此2, 4-D-般不用于 (且一般不靠近）敏感性雙子葉作物。此外，2, 4-D在禾本科作物中的用途在某種程度上受 限于可能出現的作物損傷的性質。2, 4-D和草甘膦的組合已經用于在種植免耕大豆和棉花 之前提供更強的滅生處理，然而，由于這些雙子葉物種對2, 4-D的敏感性，這些滅生處理必 須在種植前14-30天進行。
[0005] 和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2, 4-D丙酸一樣，2, 4-D是苯氧酸類除草劑。2, 4-D用 于在許多單子葉作物（如玉米、小麥和水稻）中選擇性控制闊葉雜草而不嚴重損傷目的作 物。2, 4-D是合成的植物生長素衍生物，其作用為使正常的細胞激素內穩態失調，并阻礙平 衡的受控生長。
[0006] 2, 4-D對某些植物具有不同水平的選擇性（如雙子葉植物比禾本科植物更敏感）。 不同植物對2, 4-D的不同代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2, 4-D，因 此靶位點的不同活性更可能解釋植物對2, 4-D不同的應答。2, 4-D的植物代謝一般通過兩 步代謝實現，一般是羥基化后接著與氨基酸或葡萄糖綴合。
[0007] 隨著時間的發展，微生物種群已經發展出降解此特定外來物的有效的替代途徑， 所述途徑引起2, 4-D的完全礦化。對微生物連續應用除草劑可用來選擇能利用除草劑作為 碳源用于生長（從而使其在土壤中具有競爭優勢）的微生物。因為這個原因，目前將2, 4-D 配制為具有相對短的土壤半衰期，并且對其后的作物沒有遇到明顯的遺留效應。這促進了 2,4-D的除草劑應用。
[0008] 已經廣泛研究了其降解2, 4-D能力的一種生物是真養雷氏菌（Ralstonia eutropha)。編碼礦化途徑中的第一個酶促步驟的基因為tfdA。TfdA通過α酮戊二酸依 賴性雙加氧酶反應催化2, 4-D酸轉化成二氯苯酚（DCP)。DCP與2, 4-D相比幾乎不具有除 草劑活性。TfdA在轉基因植物中用于向通常對2, 4-D敏感的雙子葉植物（如棉花和煙草） 中輸入2,4-D抗性。
[0009] 已在環境中鑒定了大量編碼能降解2, 4-D的蛋白質的tfdA型基因。許多同系物與 tfdA類似（氨基酸同一性>85% )并具有與tfdA相似的酶活性。然而，不是所有具有TauD 等結構域的蛋白質都具有2, 4-D降解功能，并且有大量同系物與tfdA具有顯著更低的同一 性（25-50%)，但卻具有與α酮戊二酸依賴性雙加氧酶Fe+ 2雙加氧酶相關的特征殘基。因 此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什么并不明確。與tfdA具有低同源性（氨基酸同 一性28% )的獨特實例是來自Sphingobium herbicidovorans的rdpA。已經顯示此酶催 化（R)-2, 4-D丙酸（和其它（R)-苯氧丙酸）以及2, 4-D(苯氧乙酸）礦化的第一步。
[0010] 隨著草甘膦抗性雜草的出現和2, 4-D除草劑的擴大應用，需要對2, 4-D敏感的目 的植物中輸入2, 4-D抗性。目前未發現24DT11除草劑抗性蛋白在植物中的表達水平和對 除草劑的耐受性報道。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是提供一種除草劑抗性蛋白質、其編碼基因及用途，本發明旨在提 供一種新的24DT11基因，所述24DT11蛋白在植物中對除草劑具有較高的耐受性。
[0012] 為實現上述目的，本發明提供了一種除草劑抗性蛋白質，包括：
[0013] (a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或
[0014] (b)在（a)中的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且 具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白質。
[0015] 為實現上述目的，本發明提供了一種除草劑抗性基因，包括：
[0016] (a)編碼所述除草劑抗性蛋白質的核苷酸序列；或
[0017] (b)在嚴格條件下與（a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有芳氧基鏈烷酸酯雙加 氧酶活性的蛋白質的核苷酸序列；或
[0018] (c)具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0019] 所述嚴格條件可為在6XSSC(檸檬酸鈉）、0. 5% SDS(十二烷基硫酸鈉）溶液中， 在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
[0020] 為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控 下的所述除草劑抗性基因。
[0021] 為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒的 重組載體。
[0022] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生除草劑抗性蛋白質的方法，包括：
[0023] 獲得包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒的轉基因宿主生物的細胞；
[0024] 在允許產生除草劑抗性蛋白質的條件下培養所述轉基因宿主生物的細胞；
[0025] 回收所述除草劑抗性蛋白質。
[0026] 進一步地，所述轉基因宿主生物包括植物、動物、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻 類。
[0027] 優選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0028] 為實現上述目的，本發明還提供了一種增加耐受除草劑范圍的方法，包括：將所述 除草劑抗性蛋白質或所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質在植物中與至少一種不同于所 述除草劑抗性蛋白質或所述表達盒編碼的除草劑抗性蛋白質的第二種核苷酸一起表達。
[0029] 進一步地，所述第二種核苷酸編碼草甘膦抗性蛋白質、草銨膦抗性蛋白質、4_羥苯 基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質或原卟啉原氧化酶。
[0030] 在本發明中，24DT11除早劑抗性蛋白質在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一 個或多個草甘膦抗性蛋白質和/或草銨膦抗性蛋白質的表達。這種超過一種的除草劑抗性 蛋白質在同一株轉基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因 來實現。另外，一種植物（第1親本）可以通過遺傳工程操作表達24DT11除草劑抗性蛋白 質，第二種植物（第2親本）可以通過遺傳工程操作表達草甘膦抗性蛋白質和/或草銨膦 抗性蛋白質。通過第1親本和第2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因 的后代植物。
[0031] 為實現上述目的，本發明還提供了一種選擇轉化的植物細胞的方法，包括：用所述 除草劑抗性基因或所述表達盒轉化多個植物細胞，并在允許表達所述除草劑抗性基因或所 述表達盒的轉化細胞生長，而殺死未轉化細胞或抑制未轉化細胞生長的除草劑濃度下培養 所述細胞，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0032] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制雜草的方法，包括：對種植作物的大 田施用有效劑量的除草劑，所述作物包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載 體。
[0033] 優選地，所述除草劑為苯氧基生長素。
[0034] 為實現上述目的，本發明還提供了一種用于保護植物免受由除草劑引起的損傷的 方法，包括：將所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物，使導入后的植 物產生足夠保護其免受除草劑損害量的除草劑抗性蛋白質。
[0035] 優選地，所述除草劑為苯氧基生長素或芳氧基苯氧鏈烷酸酯。所述植物為大豆、棉 花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0036] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性 雜草的方法，包括：對種植草甘膦耐性植物的大田施用有效劑量的除草劑，所述草甘膦耐性 植物包含所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體。
[0037] 優選地，所述除草劑為苯氧基生長素。所述草甘膦耐性植物為單子葉植物或雙子 葉植物。
[0038] 為實現上述目的，本發明還提供了一種賦予作物2, 4-D除草劑抗性的方法，包括： 將所述除草劑抗性基因或所述表達盒或所述重組載體導入植物。
[0039] 優選地，所述植物為大豆、棉花、玉米、水稻、小麥、甜菜或甘蔗。
[0040] 為實現上述目的，本發明還提供了一種除草劑抗性蛋白質耐受苯氧基生長素類除 草劑的用途，所述除草劑抗性蛋白質包括：
[0041] (a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或
[0042] (b)在（a)中的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且 具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白質。
[0043] 將所述的除草劑抗性基因或所述的表達盒或所述的重組載體導入植物，在本發明 中為將外源DNA導入植物細胞，常規轉化方法包括但不限于，農桿菌介導的轉化、微量發射 轟擊、直接將DNA攝入原生質體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。
[0044] 本發明所述的2, 4-D抗性基因及其后的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦 抗性（或高耐性和演替的）闊葉雜草物種的優良選擇。2, 4-D是廣譜、相對便宜且強力的 闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉中同樣能提供更強的作物耐受性，則可為種植者提供 優良的效用。2, 4-D耐性轉基因雙子葉植物還可在應用時間和用量上具有更高的靈活性。 2, 4-D除草劑耐性性狀的另一用途是它可用于預防2, 4-D漂移、揮發、轉化（或其它遠距離 的移動現象）、誤用、破壞等對正