2型豬鏈球菌SsnA基因敲除突變株及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及2型豬鏈球菌基因敲除突變株及其制備方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一種當前嚴重危 害集約化養豬生產的首要細菌性傳染病。該病主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、肺炎、多發性 關節炎和漿膜炎等癥狀，發病豬死亡率可高達80%，給全球的養豬業造成了巨大經濟損失。 豬鏈球菌血清型眾多，其中2型豬鏈球菌（么SS2)作為一種 重要的人畜共患傳染病病原，流行最廣、致病性最強，不僅影響養殖業的健康發展，還危害 著人類的健康，甚至能致人死亡，給公共衛生安全帶來了嚴重威脅。
[0003] 迄今為止，對豬鏈球菌的致病機理和毒力因子的認識非常有限，基本得到確認的 毒力因子有莢膜多糖（CPS)、溶菌酶釋放蛋白（MRP)、胞外因子（EF)、溶血素（SLY)等，對于 已經發掘的這些毒力相關因子都是處在推測和假定的階段，缺少相關的遺傳操作技術進一 步證明這些相關因子與毒力的確切關系以及其分子機制，同時由于毒力因子的多樣性和 復雜性，單靠現有毒力因子還不足以解釋導致豬鏈球菌病暴發的原因。目前有差減雜交 (subtraetivehybridization)、體內互補篩選法（invivocomplementation)、轉座子系統 (transposonsystem)、體內表達技術（invivoexpressionteehnology，IVET)和突變體庫法 (signature-taggedmutagenesis，sTM)等多種篩選毒力因子基因的方法。但這些方法僅僅 是初步篩選出可能的毒力因子，對于這些基因具體的功能及對致病力等方面的影響不能做 出全面的解釋。
[0004] 在豬鏈球菌毒力基因研究中，很多學者通過構建某一基因的敲除突變株，并與野 毒株比較，來研究該基因在豬鏈球菌致病中的作用。基因敲除技術是在80年代后期應用 DNA同源重組原理發展起來的，雖然它的出現僅20余年，但是發展卻非常迅速，隨著人類基 因組草圖的完成，已發展成為后基因組時代的重要研究內容。該技術的基本原理是通過事 先設計好的目標基因上下游的同源片段，和基因組發生同源交換，從而將靶基因片段置換 下來，以實現敲除目的基因的目的。然后對敲除的個體進行研究，通過其性狀的變化而研究 被敲除基因的功能。
[0005] 許多革蘭氏陽性菌（G+)均能表達和分泌核酸酶類蛋白，Fontaine等在豬鏈球菌 致病菌株SX332和后來的1-9型菌株中，發現了一種分泌型核酸酶SsnA。基因大小 為3126 bp，通過軟件分析預測，包括35個氨基酸為分泌信號肽序列，22個氨基酸為DNA結 合區域和典型的G+細胞壁基序。目前為止基因在豬鏈球菌中所發揮的生物學功能尚 不清楚。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供2型豬鏈球菌基因敲除突變株及其構建方法和應 用。
[0007] 本發明所采取的技術方案是： 2型豬鏈球菌基因敲除突變株SS2-GD01 A SsnA，其是由2型豬鏈球菌SS2-GD01 株中的基因被氯霉素抗性基因盒代替后所得。
[0008] 所述的2型豬鏈球菌基因敲除突變株SS2-GD01 A SsnA已于2014年10月 31日保藏于中國典型培養物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION， CCTCC)，地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO :M 2014539。
[0009] 一種2型豬鏈球菌基因敲除突變株SS2-GD01 A SsnA的構建方法，包括如下 步驟： (1) 以2型豬鏈球菌基因組DNA為模板，擴增基因上游序列Pl和下游序列P2; 以穿梭質粒PSET3為模板，擴增氯霉素抗性基因盒序列6?/1; (2) 將步驟（1)得到的三個片段的基因序列分別連接到T載體上，經測序鑒定正確后 酶切回收目的基因片段PUCAT和P2 ; (3) 將步驟（2)得到的酶切后目的基因PI、CAT和P2定向以P1-CAT-P2的順序連接 到溫敏型自殺性載體質粒PSET4S中，得到自殺性質粒pSET4SASsnA; (4) 將自殺性質粒pSET4S ASsnA轉入2型豬鏈球菌野生型菌株中，篩選具有氯 霉素抗性的克隆，利用PCR鑒定和測序證實獲得2型豬鏈球菌基因敲除突變株 SS2-GD01 ASsnA。
[0010] 所述2型豬鏈球菌為2型豬鏈球菌廣東分離株SS2-GD01，已于2014年10月31日 保藏于中國典型培養物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)， 地址：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO :M 2014538。
[0011] 所述基因上游序列P1如SEQ ID NO: 1所示，所述基因下游序列P2如 SEQ ID NO:2所示，氯霉素抗性基因盒序列UT^SEQ ID NO:7所示。 步驟（4)的具體操作為： 1) 將PSET4S ASsnA質粒加入新鮮制備的2型豬鏈球菌野生菌株電轉感受態細胞中進 行電擊，復蘇離心后將上清涂布含有壯觀霉素抗性（Spc K)的大豆胰蛋白瓊脂培養基（TSA) 平板上，于28°C、5% CO2培養48 h，將成功轉化的具有SpcK的單克隆接種于含有氯霉素抗 性（CmK)的大豆胰蛋白肉湯（TSB)培養基，在28°C、5% CO2條件下培養12 h，按照1%的比 例轉接無抗性的TSB培養基連續培養兩代后，轉入37°C水浴搖床培養12 h，稀釋IO3涂TSB CmK平板，1 %轉接后繼續在37°C水浴搖床培養12 h，如此1 %轉接幾代，每一代稀釋IO5涂 TSB CmK平板，置于37°C、5% CO2孵箱中培養，以獲得含有同源重組菌株的克隆； 2) 經4對PCR引物鑒定及測序后證實基因被氯霉素抗性基因盒所替代，獲得了 2 型豬鏈球菌基因敲除突變株SS2-GD01 A SsnA。
[0012] 所述2型豬鏈球菌基因敲除突變菌株SS2-GD01 A SsnA在制備2型豬鏈球菌 減毒疫苗及多價基因工程疫苗上的應用。
[0013] 本發明的有益效果是： 本發明對SS2-GD01 A SsnA菌株的遺傳穩定性、生長特性、對H印-2細胞的黏附和入侵 以及動物致病力進行了分析。SS2-GD01 A SsnA菌株的遺傳穩定性鑒定表明基因的缺 失是穩定的，基因敲除突變菌株的生長特性同野生菌株相似，其在體外與Hep-2細胞的黏 附和入侵能力明顯下降，提示基因與細胞黏附能力相關。小鼠致病力試驗結果表明突 變株SS2-GD01 A SsnA的毒力明顯下降，提示參與了 2型豬鏈球菌的致病過程，是一種 新的毒力相關因子。該突變菌株為多價亞單位疫苗的保護性抗原的篩選提供了重要的線 索，可應用于2型豬鏈球菌減毒疫苗的開發研制。
[0014] 本發明構建的SS2-GD01 A SsnA，為進一步研究2型豬鏈球菌的致病機理奠定了基 礎，同時為有效的防控豬鏈球菌病提供了技術支持。
【附圖說明】
[0015] 圖1 :豬鏈球囷基因局支除不意圖； 圖2:豬鏈球菌基因上游序列擴增產物電泳圖（M: DL2 000 DNA Mark, I: 上游序列）； 圖3:豬鏈球菌基因下游序列擴增產物電泳圖（M: DL2 000 DNA Mark, I: 下游序列）； 圖4:氯霉素抗性基因表達盒擴增產物電泳圖（M: DL2 000 DNA Mark, I: 列）； 圖5 :重組自殺性載體質粒pSET4S A SsnA的PCR鑒定結果電泳圖（1 :部分插入片段序 列，M: DL2 000 DNA Mark); 圖6 :豬鏈球菌16s rRNA引物擴增基因敲除突變菌株SS2-GD01 A SsnA產物電泳圖（M: 012 000 0嫩1&14，1:1120對照，2:168冰隱序列）； 圖7 : 基因敲除鑒定引物擴增基因敲除突變菌株SS2-GD01 A SsnA產物電泳圖 (M:DL2 000 DNA Mark, I: SS2-GD01ASsnA 擴增序列）； 圖8 : 基因內部鑒定引物擴增基因敲除突變菌株SS2-GD01ASsnA產物電泳圖 (M:DL2 000 DNA Mark, l:SS2-GD01ASsnA 擴增序列，2:SS2-GD01 擴增序列）； 圖9:Spc引物擴增基因敲除突變菌株SS2-GD01ASsnA產物電泳圖（M:DL2 000 DNA 1&14，1:552-6001八581^擴增序列，2 3