一種快速選育土霉素菌種的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于土霉素菌種選育的技術領域，具體涉及一種快速選育土霉素菌種的方法。
【背景技術】
[0002]土霉素(Spectn1mycni)是龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)有氧發酵后生成的次級代謝產物，為四環類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抑制能力，對多種球菌和桿菌有抗菌作用，對立克次體和阿米巴病蟲也有抑制作用，用來治療上呼吸道感染、胃腸道感染、斑瘆傷寒、恙蟲病、支原體和衣原體屬感染等疾病。
[0003]土霉素主要用做畜禽用藥及飼料添加劑，此外，以土霉素為原料生產半合成抗生素的市場前景較好，比如用其合成的強力霉素(多西霉素)，其市場價格是土霉素的5-7倍，用其為原料生產的美他環素，臨床效果優于土霉素，很多企業將土霉素、維生素B1、維生素B6等組成復方土霉素，能使土霉素療效增加，還能降低消化道副反應，是良好的動物飼料添加劑。因此，對土霉素菌株的選育和研宄具有很好的經濟效益和社會效益。
[0004]現有技術中在選育高產量和高通量的土霉素菌株時，采用的方法是:斜面-孢子懸液-孢子懸液預處理-分離培養基-斜面-種瓶培養基-發酵培養基。例如專利申請號為201410087566.2的專利《一種土霉素高產菌株及其高通量篩選方法》中即為這種方法，其在制備了種子懸浮液之后還用0.5-1.5uL亞硝基胍溶液對種子懸浮液進行處理，之后才進行分離培養，而在分離培養之后，將分離培養得到的單菌落又經過了斜面培養基的培養和種子搖瓶的培養才進行發酵培養，通過這種篩選方法其驗證周期長，影響篩選效率，操作麻煩，篩選通量小，高產菌株的篩出概率低。
【發明內容】
[0005]本發明為了解決現有技術中土霉素工業菌種的篩選周期長，影響工作效率的技術問題，提供了一種快速選育土霉素菌種的方法。
[0006]本發明為實現其目的采用的技術方案是:
[0007]一種快速選育土霉素菌種的方法，包括以下步驟:
[0008]a.試管斜面培養:將土霉素生產菌株砂土孢子接種于試管斜面培養基中，在溫度37.0±0.5°C，濕度40% -60%的條件下培養3_5天，得到斜面孢子；
[0009]b.孢子懸液制備:向步驟a試管斜面培養基中加入無菌水，將步驟a得到的斜面孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為112-1O14個/mL ；
[0010]C.分離培養:將步驟b所得的孢子懸液用無菌水稀釋至11-1O7倍，稀釋液涂布在分離培養基上，于溫度37.0±0.50C，濕度40% -60%的條件下暗培養3_5天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；
[0011]d.發酵培養:在分離培養基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到25mL發酵培養基中，于32.0±0.5°C，濕度為40-60 %，轉速為200_220rpm條件下震蕩培養48_50h，生長到周期后檢測發酵液中土霉素含量，選高于效價500U/mL的菌株進行砂土干燥保藏；
[0012]e.菌株復試:取步驟d沙土干燥保藏的菌株轉接試管斜面培養基，于37.0±0.5°C,40% -60%濕度條件下培養3_5天，得斜面孢子，將所得的斜面孢子轉接至種子培養基中，于30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養24_30h，將培養好的種液轉接至復試用發酵培養基中，于30.0±0.5°C，200-220rpm條件下震蕩培養5_7天，取樣檢測效價。
[0013]所述的試管斜面培養基按質量百分比的組成為:6.0% -7.0 %麩皮，2.0% ~2.5%瓊月旨。
[0014]所述的步驟a中，濕度為45% -55%，培養時間為4天。
[0015]所述的步驟c中，分離培養基按質量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，0.1% -0.3% 硫酸銨，0.1% -0.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5% 氯化鈉，2.0% -2.5%瓊脂。
[0016]所述的步驟c中，濕度為45% -55%，培養時間為4天。
[0017]所述步驟d中，發酵培養基按質量百分比的組成為:4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2% 玉米漿，0.5% -1.0% 黃豆粉，0.2% -0.3% 硫酸銨，0.2% -0.3% 碳酸鈣，0.1% -0.2%氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀。
[0018]所述步驟d中，濕度為45-55%，轉速為220rpm，震蕩培養49h。
[0019]所述步驟e中，種子培養基按質量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，2.0% -3.0% 黃豆粉，0.1% -0.3% 硫酸銨，0.1% -0.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉。
[0020]所述步驟e中，復試用發酵培養基成分及其含量為:10% -15%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，2.0% -3.0% 黃豆粉，1.0% -L 5% 硫酸銨，1.0% -1.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉，0.01% -0.05%磷酸二氫鉀，0.1% -0.3%聚醚消沫。
[0021]本發明的有益效果是:本發明所述快速選育土霉素菌種的方法，通過將分離培養得到的單菌落直接接種于發酵培養基中，將土霉素菌種篩選中的效價驗證周期由192h縮短為48-50h，縮短了驗證時間，提高了工作效率，而且選育出的土霉素具有高產的特點。
[0022]原來的土霉素發酵技術采用斜面孢子挖塊的方式接種，而本文方法使用單菌落孢子接種，后者孢子量較小，從而降低發酵培養基的裝量，節省了原料，降低了成本；通過將分離培養得到的單菌落直接接種于發酵培養基中換了一種驗證工藝思路，減少了驗證工藝中需要的較大的接種量，而在工藝思路改變的前提下，所要解決的技術關鍵是單菌落接到發酵瓶以后的孢子快速生長繁殖的發酵培養工藝，在步驟d發酵培養的過程中由于接種孢子量的減少，在發酵的研宄中發現溫度對孢子的萌發、菌絲的生長繁殖、抗生素的產生有著至關重要的影響，將溫度控制在32.0±0.5°C，并同時需要將步驟d中發酵培養基的配方嚴格控制為“4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2%玉米漿，0.5% -1.0%黃豆粉，0.2% -0.3%硫酸銨，0.2% -0.3%碳酸鈣，0.1% -0.2%氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀”在較低的淀粉、黃豆粉等營養物質下配合32.0±0.5°C的培養溫度才能實現孢子快速萌發、菌絲快速生長繁殖、產生抗生素。
【具體實施方式】
[0023]本發明為了解決現有技術中土霉素工業菌種的篩選周期長，影響工作效率的技術問題，提供了一種快速選育土霉素菌種的方法。下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0024]實施例1.
[0025]試管斜面培養基按質量百分比的組成為:6.0% -7.0%麩皮，2.0% -2.5%瓊脂。
[0026]分離培養基按質量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5%玉米漿，0.1% -0.3%硫酸銨，0.1% -0.5%碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉，2.0% -2.5%瓊脂。
[0027]發酵培養基按質量百分比的組成為:4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2%玉米漿，0.5% -1.0 % 黃豆粉，0.2% -0.3% 硫酸銨，0.2% -0.3% 碳酸鈣，0.1% -0.2% 氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀。
[0028]a.試管斜面培養:將土霉素生產菌株砂土孢子接種于試管斜面培養基中，每支試管斜面的砂土孢子接種量為，在溫度37.0±0.5°C，濕度40%的條件下培養5天，得到斜面孢子；
[0029]b.孢子懸液制備:向步驟a試管斜面培養基中加入無菌水，將步驟a得到的斜面孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為112-1O14個/mL ;
[0030]c.分離培養:將步驟b所得的孢子懸液稀釋至11-1O7倍，稀釋液涂布在分離培養基上，于溫度37.0±0.50C，濕度40%的條件下暗培養5天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；
[0031]d.發酵培養:在分離培養基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到25mL發酵