一株高凝聚性戊糖片球菌及其在凈化水體中副溶血性弧菌中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株從發酵豆制品中篩選出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在凈化水體中的副溶血性弧菌中的應用。
【背景技術】
[0002]副溶血性弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)，廣泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海產品引發食物中毒的重要病原菌，也是水產動物細菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生動物弧菌病、降低水體中副溶血性弧菌載量的重要手段是使用抗生素及化學制劑，但隨之導致耐藥性細菌產生及抗生素殘留等問題，對食品安全造成重大影響，因此亟需開發新的手段來進行水體減菌和凈化處理。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水體中的副溶血性弧菌的減菌和凈化處理，而避免使用化學抑菌劑和抗生素來進行水體減菌和凈化處理，為養殖和暫養水體中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同時有利于預防副溶血性弧菌引起的水生動物疾病和食源性疾病的傳播。
[0004]本發明從發酵豆制品鹵水中分離出一株戊糖片球菌F28-8 (Ped1coccuspentosaceus)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研宄所，其菌種保藏編號為:CGMCCN0.9956，保藏日期為2014年11月13日，菌種的分類命名為戊糖片球菌，Ped1coccuspentosaceuso
[0005]本發明中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物學特性:
(O形態特征:戊糖片球菌F28-8革蘭氏染色結果為陽性，細胞呈圓球形，成對或四聯排列，無芽胞，無莢膜，無鞭毛。
[0006](2)菌落特征:戊糖片球菌F28-8在MRS固體培養基上生長良好，菌落形態為圓形、乳白色、光滑、凸起，邊緣整齊，不透明。
[0007](3)生理生化特征:過氧化氫酶陰性，不產生吲哚、硫化氫和氨，不還原硝酸鹽，不水解精氨酸，可發酵葡萄糖，不發酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可從纖維二糖、七葉苷、蘀糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖發酵產酸。
[0008](4)對副溶血性弧菌具有強烈的凝聚性和抑菌性。
[0009]本發明從發酵豆制品中的戊糖片球菌中分離出戊糖片球菌分離株，通過測定其對副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，篩選出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通過電鏡來觀察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微觀結構，測定其對水體中致病性副溶血性弧菌存活率的影響來考察其對水體中副溶血性弧菌凈化效應，具體包括以下步驟: (I)菌株復蘇培養戊糖片球菌F28-8接種5 mL MRS液體培養基，tdh基因陽性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接種LBS液體培養基，備用。
[0010](2)抑菌能力測定用瓊脂孔擴散法，通過測定戊糖片球菌菌株無細胞提取液對副溶血性弧菌在LBS固體平板上的抑菌圈的大小來檢測其抑菌能力。
[0011](3)共凝聚能力測定調節戊糖片球菌的菌懸液的濃度，將調好濃度的戊糖片球菌懸液與相應的副溶血性弧菌菌懸液各取混合，測定吸光值，記作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌懸液作為對照，按照以下公式:{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100來計算細菌共凝聚率，其中Ap和Av分別為戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌懸液在600 nm處測所測的A值。
[0012](4)凝聚細胞的電鏡觀察吸取自凝聚2 h的未混合戊糖片球菌的菌懸液樣品進行掃描電鏡，吸取共凝聚2 h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌懸液樣品進行掃描電鏡，分別觀察細胞的結構和凝聚特征。
[0013](5)凝聚過程中副溶血性弧菌存活細胞測定將戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌懸液在37°C混合靜置培養2 h、12h、24h、60h、96h后，分別吸取樣品中上層和下層溶液通過選擇性TCBS瓊脂平板測定體系中的細菌濃度。
[0014]本發明的有益效果是:
戊糖片球菌(Ped1coccus pentosaceus)，是乳酸菌中的一個種，廣泛分布于蔬菜、干酪、香腸等傳統發酵食品中，是公認的具有安全性的微生物。該菌代謝糖類產生乳酸，并產生IIa類片球菌素，對病原菌及腐敗微生物產生強烈的抑制效應，其中一些菌株具有提高動物天然免疫能力、促進健康以及抵抗病原菌的侵襲等益生特性，以戊糖片球菌及其代謝產物研發新型抑菌劑和微生態制劑對食品和環境中弧菌凈化控制以及弧菌病的生物防治具有潛在價值和廣闊前景。
[0015]本發明的戊糖片球菌F28-8對致病性副溶血性弧菌具有較強的抑菌性能、共凝聚能力，其抑菌活性對氧化氫酶、蛋白酶以及高溫條件均不敏感，因此可應用范圍廣。電鏡顯示該菌具有獨特的細胞表面結構和細胞粘聚方式，易于自凝聚形成大的團簇，并與副溶血性弧菌形成緊密的共凝聚物，從而對水體中的副溶血性弧菌的減菌和凈化處理。水體中的副溶血性弧菌經戊糖片球菌F28-8的共凝聚作用后，上層懸液和凝聚物中的可培養細胞均顯著減少。
【附圖說明】
[0016]圖1:不同凝聚性的戊糖片球菌細胞的掃描電鏡結果。
[0017]圖2:戊糖片球菌共凝聚對水體中副溶血性弧菌可培養細胞數的影響。
【具體實施方式】
[0018]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
[0019]除非特別說明，本發明實施例所用培養基和試驗條件為本領域常規培養基和試驗。除非特別說明，本發明實施例所用試劑均為市購。
[0020]實施例1菌株復蘇培養
將戊糖片球菌保種液于O°C解凍，無菌吸取200 μ L保種液接種于10 mL的MRS液體培養基中，在37 °C厭氧條件下培養24 h，取培養物劃線接種于MRS固體平板上，在37 °C厭氧培養24 h，然后挑取單菌落接種于5 mL的MRS液體培養基，在37°C厭氧條件下培養24 h，備用O
[0021]將tdh基因陽性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接種于LBS液體培養基，在37°C振蕩培養16 h;取培養物劃線于TCBS平板，在37°C培養20 h，挑取單菌落接種5 mLLBS液體培養基，在37°C恒溫振蕩條件下培養12 h，備用。
[0022]實施例2抑菌能力測定
戊糖片球菌F28-8、Y27-4、Y45-30、H13,、H6、HlO和F3的抑菌能力對比測定:
在70°C、100°C、121°C不同溫度下分別將戊糖片球菌培養物12000g離心15 min，取上清液，通過0.22 Mffl的微孔濾膜除菌，獲得戊糖片球菌培養物無細胞提取液。使用瓊脂孔擴散法對菌株無細胞提取液的抑菌能力進行測定:用無菌生理鹽水將副溶血性弧菌的菌懸液稀釋到18 CFU /mL，移取I mL菌懸液于LBS固體平板中，涂布均勻，于超凈工作臺中晾干15 min，用打孔器在平板中均勻打直徑為10 mm的小孔，每孔加入200μ?戊糖片球菌培養物無細胞提取液和用9 mg /mL過氧化氫酶、I mg /mL蛋白酶K和I mg /mL胰蛋白酶處理。將三個不同條件70°C、100°C、121°C下處理的菌株分別各做3孔平行，室溫擴散5 h，然后放置于37°C下培養過夜，用游標卡尺進行測量并記錄抑菌圈直徑。將MRS液體培養基用乳酸調節PH到與作為對照的受試菌株無細胞提取液的pH相同，并比較不同處理組的抑菌效果。
[0023]本研宄試驗中的7株戊糖片球菌的代謝產物對致病性副溶血性弧菌ATCC33847都顯示了強烈的抑制效應，抑菌圈直徑在21.0 mm至25.5mm之間，是同pH乳酸對照的1.1至
1.3倍，其中F28-8具有最強的抑菌作用。培養上清經過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及加熱處理后抑菌效果有不同程度的降低，但殘留抑菌效果仍在75-96%之間，結果表明戊糖片球菌F28-8代謝產生的有機酸是對副溶血性弧菌生長抑制作用的主要因素，過氧化氫產生以及細菌素等蛋白質類抑菌成分作用相對較小。
[0024]實施例3共凝聚能力測定
戊糖片球菌F28-8、Y27-4、Y45-30、H13