一種食線蟲真菌實驗室批量化培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物寄生線蟲病生物防治用菌種實驗室批量化培養方法，具體涉及一種食線蟲真菌實驗室批量化培養方法。
【背景技術】
[0002]動物寄生線蟲病是家畜感染的一類嚴重的寄生蟲病，給畜牧業造成嚴重的危害，藥物驅蟲是其主要的控制措施。隨著化學驅蟲藥所產生蟲體抗藥性問題、藥物在動物性食品中殘留對人體健康的威脅以及藥物降解產物對生態環境的不良影響等的弊端被廣泛認識。利用食線蟲性真菌控制寄生性線蟲感染來防治動物線蟲病的新的生物技術倍受關注，食線蟲性真菌是針對線蟲的幼蟲發揮作用，在其感染動物之前就將其殺死，避免了家畜的感染或重復感染，減輕了寄生蟲對動物的危害程度，對于保護環境、維護生態平衡、發展無污染的綠色畜產品，具有極為重要的意義。目前，食線蟲真菌的生產量少，不能滿足批量化培養。迫切需要探索一種食線蟲真菌實驗室批量化培養的生產工藝。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是，提供一種食線蟲真菌實驗室批量化培養方法。
[0004]本發明解決其技術問題采用的技術方案是:一種食線蟲真菌實驗室批量化培養方法，包括以下步驟:
(1)將保存于2?6°C的試管斜面中的食線蟲真菌菌種，轉接于I%麩皮平板培養基，25?28°C避光培養4?7天，菌絲長滿平皿的三分之二至長滿培養皿的培養物作為一級種子;
(2)用無菌手術刀將步驟(I)中含有一級種子的培養物切去4mmX4mm的方塊2?3個，轉接于含2%麩皮液體培養基的三角燒瓶中，根據菌種生長速度不同，在轉速80?160r/min振搖培養120?144小時，將振搖培養后的液體培養物作為二級種子；
(3)將玉米粒、小麥粒復合培養基分裝于長37?45cm、寬11?15cm、一面裝有直徑為5?8cm除菌濾膜的聚乙烯塑料袋中，121 °C高壓滅菌30?35分鐘，冷卻后將步驟⑵中所述的二級種子按5%?10%種子接種量接種于含有300?600g的玉米粒、小麥粒的所述聚乙烯塑料袋中，封口后輕按壓袋子，使其混合均勻，然后置于25?28°C培養15?30天終止培養，即可收獲分生孢子和厚垣孢子，以供動物寄生線蟲病生防制劑的配制。
[0005]進一步，步驟(I)中，所述I %麩皮平板培養基由1g新鮮麩皮，蒸飽水100ml制成麩皮浸出液，瓊脂粉濃度為2 %，制成。
[0006]進一步，步驟(2)中，所述2%麩皮液體培養基由20g新鮮麩皮，蒸餾水100ml制成麩皮浸出液，紅糖濃度為2%，制成；所述振搖培養先在轉速80r/min振搖48?72小時，然后在轉速160r/min振搖72小時。
[0007]進一步，步驟(3)中，所述玉米粒、小麥粒復合培養基由玉米粒與小麥粒之比為1.5: I?2: 1，玉米粒和小麥粒與水比為1.3?1.6: I制成。
[0008]本發明食線蟲真菌實驗室批量化培養方法在實驗室條件下可批量化生產，為今后工廠化生產動物寄生蟲病生物制劑奠定了堅實的基礎，實驗證明，本發明分生孢子或厚垣孢子的產量可達1.20X 104?1.75X 10 6個/克。
【具體實施方式】
[0009]下面結合實施例對本發明進一步加以說明。
[0010]實施例1
(1)將保存于4°C的試管斜面中的食線蟲真菌-鞭式達丁屯氏菌Duddingtoniaflagrans(與鞭式節叢孢Arthorbotiys flagrans同物異名)菌種，轉接于I %麩皮平板培養基，26°C避光培養6天，菌絲長滿平皿的培養物作為一級種子。其中，I %麩皮平板培養基的制備方法是:稱取1g新鮮麩皮加入蒸餾水1000ml，微火煮沸I小時，紗布過濾，沉淀后，取上清液按每10ml加瓊脂粉2g混合后，然后分裝于三角燒瓶中，121 °C高壓滅菌20分鐘，即成。
(2)用無菌手術刀將含有一級種子的培養物切去4mmX4mm的方塊2個，轉接于含2%麩皮液體培養基的三角燒瓶中，置26°C培養，先80r/min振搖60小時，然后160r/min振搖培養72小時后的液體培養物作為二級種子。其中，2%麩皮液體培養基的制備方法是:將20g麩皮加入蒸餾水100ml按步驟(I)的方法制成浸出液，上清液按每10ml加2g紅糖混合后，然后分裝于三角燒瓶中，121°C高壓滅菌20分鐘，即成。
(2)將玉米粒、小麥粒復合培養基分裝于長37cm、寬Ilcm的聚乙稀塑料袋中，該塑料袋一面裝有直徑5cm的除菌濾膜以便于通氣，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻后將二級種子按5%種子接種量接種于含有410g的玉米粒、小麥粒的上述塑料袋中，封口后輕按壓袋子，使其混合均勻，然后置于26°C培養，根據菌種的生長特性不同，培養18天終止培養，收獲少量的分生孢子和大量的厚垣孢子，其厚垣孢子產量為1.75 X 16個/克，以供動物寄生線蟲病生防制劑的配制。其中，玉米粒、小麥粒復合培養基的制備方法是:稱取玉米260g、小麥150g，兩者相互混合，加入自來水260ml，然后分裝于長37cm、寬Ilcm的聚乙稀塑料袋中，該塑料袋一面裝有直徑5cm的除菌濾膜以便于通氣，121°C高壓滅菌30分鐘，即成。
[0011]實施例2
(1)將保存于4°C的試管斜面中的少孢節叢孢(Arthorbotiysoligospora)菌種，轉接于I %麩皮平板培養基，25°C避光培養4天，菌絲長滿平皿的三分之二后的培養物作為一級種子。
(2)用無菌手術刀將含有一級種子的培養物切去4_X4_的方塊3個，轉接于含2%麩皮液體培養基的三角燒瓶中，置25°C培養，先80r/min振搖48小時，然后160r/min振搖培養72小時，將此液體培養物作為二級種子。
(3)將玉米粒、小麥粒復合培養基分裝于長37cm、寬Ilcm的聚乙稀塑料袋中，該塑料袋一面裝有直徑5cm的除菌濾膜以便于通氣，121 °C高壓滅菌30分鐘，冷卻后將二級種子按10%種子接種量接種于含有480g的玉米粒、小麥粒的上述塑料袋中，封口后輕按壓袋子，使其混合均勻，然后置于26°C培養，根據菌種的生長特性不同，培養30天終止培養，收獲分生孢子和少量的厚垣孢子，孢子產量為2.1 X 15個/克，以供動物寄生線蟲病生防制劑的配制。其中，玉米粒、小麥粒復合培養基的制備方法是:稱取玉米360g、小麥120g，兩者相互混合，加入自來水300ml，然后分裝于長37cm、寬Ilcm的聚乙稀塑料袋中，該塑料袋一面裝有直徑5cm的除菌濾膜以便于通氣，121°C高壓滅菌30分鐘，即成。
[0012]實施例3
(1)將保存于4°C的試管斜面中的厚垣普奇尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)菌種，轉接于I %麩皮平板培養基，28°C避光培養7天，菌絲長到平皿的三分之二的培養物作為一級種子。
(2)用無菌手術刀將含有一級種子的培養物切去4_X4_的方塊3個，轉接于含2%麩皮液體培養基的三角燒瓶中，置28°C培養，先80r/min振搖72小時，然后160r/min振搖培養72小時后的液體培養物作為二級種子。
(3)將玉米粒、小麥粒復合培養基然后分裝于長37cm、寬Ilcm的聚乙稀塑料袋中，該塑料袋一面裝有直徑5cm的除菌濾膜以便于通氣，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻后將二級種子按10%種子接種量接種于含有300g的玉米粒、小麥粒的上述塑料袋中，封口后輕按壓袋子，使其混合均勻，然后置于28°C培養，根據菌種的生