一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體及其篩選方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物學領域，尤其涉及一種新型三疣梭子蟹呼腸孤病毒(SCRV)受體以及利用受體蛋白抗體進行對SCRV病毒感染的防治。
【背景技術】
[0002]三捷梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經濟動物，肉味鮮美、營養豐富，深受廣大消費者的青睞，也是重要的出口創匯品種。目前三疣梭子蟹是世界上養殖規模最大的海洋經濟蟹類。近年來，秋冬季節常出現由梭子蟹呼腸孤病毒引起的疫病使梭子蟹大量死亡的現象，給養殖產業帶來重要的經濟損失。所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒的毒株為R1015株，保藏號為CGMCC N0.5379，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。(類)呼腸孤病毒是中華絨螯蟹(Er1cheirsinensi)、據緣青蟹(Scylla serrata)和三統梭子蟹(Portunus trituberculatus)的重要病原，哺乳動物呼腸孤病毒受體研宄較系統深入而蟹類呼腸孤病毒受體研宄尚未被報道。
[0003]由于病毒受體及病毒與受體間的互作是病毒感染的關鍵點而受到廣泛的重視從而成為研發熱點，已有眾多人、畜、禽病毒的細胞受體被闡明，而水生動物病毒受體研宄遠落后于人、畜、禽病毒。主要的報道有牙鲆淋巴囊腫病毒、WSSV和海洋雙RNA病毒Marinebirnavirus (MABV)。水生生物呼腸孤病毒與細胞受體互作方面，寥有的幾篇報道主要是關于草魚呼腸孤病毒的。通過對三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體的研宄對預防及控制該病毒提供有效策略。
[0004]病毒受體的研宄方法比較多，如從基因水平上入手的方法有酵母雙雜交技術、克隆表達技術、噬菌體展示技術等。從蛋白質水平入手的方法，如病毒鋪覆蛋白印跡技術(VOPBA)、免疫共沉淀技術等，這些方法的優點是直接、客觀。目前，國內外還沒有公開任何關于三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體及該受體的阻斷抑制劑的相關研宄報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體，同時利用該受體蛋白免疫小鼠所得到的抗體作為受體阻斷劑，該阻斷劑對三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染細胞有抑制活性，可以開發防治三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染的藥物。
[0006]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體，所述的受體為微管蛋白。
[0007]上述三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體的篩選方法，具體步驟如下:
(I)將健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鰓，按質量體積比Ig: (5 - 10)ml加入到預先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中勻漿，將勻漿液于4°C，600g離心3min，取上清液于4°C，6000g離心5min后，再取上清液于4°C，35000g離心2h，將得到的沉淀用膜蛋白提取液重懸，即得到三疣梭子蟹鰓膜蛋白提取液； (2)將三疣梭子蟹鰓膜蛋白提取液進行8 % SDS-PAGE電泳后，在電轉液中將凝膠上所有蛋白條帶轉移至PVDF膜上，300mA, 4°C轉移3h，轉移結束后，將PVDF膜從電轉槽中取出，用去離子水與PBST緩沖液稍加漂洗后，浸沒于20-25ml封閉液中，40r/min室溫搖動封閉過夜，將封閉過夜的PVDF膜用PBST緩沖液洗3次，每次5min，將洗滌后的PVDF膜放入塑料袋中，加lmL12.9ug/ml三疣梭子蟹呼腸孤病毒，用封口機封住，室溫搖動孵育Ih后，用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min ;然后將PVDF膜置于雞抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒一抗稀釋液中，在室溫下搖動孵育2h，再用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min ;再將PVDF膜置于HRP-羊抗雞二抗稀釋液中，在室溫下緩慢搖動孵育lh，再用PBST緩沖液洗滌3次，每次1min后，將PVDF膜用PBS緩沖液洗5min后，用鄰苯二胺在37°C下避光顯色15min，PVDF膜上顯色的蛋白條帶為三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體。
[0008]步驟⑴中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下:pH 8.0的lmol/L Tris-HCl100ml、MgCl2.6Η20 0.4063g、0.lmol/L EDTA 10ml,TritonX-100 2ml，補足雙蒸水至 1L，高壓滅菌。
[0009]步驟(2)中所述的電轉液配制方法為:Tris 3g、甘氨酸14.4g，甲醇200ml，補足雙蒸水至IL ;所述的封閉液為含5wt%脫脂牛奶的PBST緩沖液；所述的雞抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒一抗稀釋液為雞抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒一抗用含0.5wt%脫脂牛奶的PBST緩沖液稀釋1000倍所得；所述的HRP-羊抗雞二抗稀釋液為HRP-羊抗雞二抗用含0.5wt%脫脂牛奶的PBST緩沖液稀釋5000倍所得。
[0010]所述的PBST 緩沖液配制方法如下:NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KH2PO40.2g，500 μ L吐溫_20，補足雙蒸水至1L，調節pH至7.4，高壓滅菌；所述的PBS緩沖液配制方法如下:NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KH2PO40.2g，補足雙蒸水至 1L，調節pH至7.4，高壓滅菌。
[0011]步驟(2)中所述的雞抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒一抗的制備:取健康的初產蛋的母雞作為免疫對象，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進行基礎免疫，每只母雞免疫劑量為500-800 μ g/mL，15-20天后，將三疣梭子蟹呼腸孤病毒抗原和弗氏不完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對母雞肌肉注射進行加強免疫，每只母雞免疫劑量為400-600 μ g/mL,加強免疫重復進行三次，每次間隔時間為7-10天，進行三次免疫后收集雞蛋測定效價，當卵黃抗體效價>1:20000時收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體。卵黃抗體的純化的具體方法如下:稱取適量卵黃，按1:9加入乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.05M，PH5.0)，攪拌均勻后4°C靜置過夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，1000g離心20min，沉淀用10-20倍卵黃質量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過夜，1000g離心20min，取沉淀用少量PBS溶液(0.01M,PH7.4)重懸，在PBS溶液中透析過夜，即得到雞抗三疣梭子蟹呼腸孤病毒一抗，于_80°C保存備用。
[0012]所述的微管蛋白在制備用于阻斷SCRV病毒感染細胞的受體阻斷劑方面的用途。
[0013]所述的受體阻斷劑為三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體抗體，其具體制備方法如下: 所述的微管蛋白用0.9%氯化鈉懸浮，將微管蛋白和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對小鼠皮下注射進行基礎免疫，每只小鼠免疫劑量為10-20 μ g/mL, 15天后，將微管蛋白和弗氏不完全佐劑進行等體積混合，充分乳化后對小鼠皮下注射進行加強免疫，每只小鼠免疫劑量為8-15 μ g/mL，加強免疫重復進行3次，每次間隔時間為7_10天，最后一次免疫后，對小鼠進行摘眼球取血，將血液室溫下放置lh，轉移至4°C靜置3-5h，用針頭輕輕將血撥弄后，于4°C，3000g離心lOmin，取血清，即得到三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體抗體，于-80°C保存備用。
[0014]所述的三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體抗體用于開發成防治三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染方面的應用。
[0015]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明首次公開了一種三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體及其篩選方法和應用，利用該受體蛋白免疫小鼠所得到的抗體作為受體阻斷劑，該阻斷劑對三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染細胞有抑制活性，可以開發防治三疣梭子蟹呼腸孤病毒感染的藥物，從而為三疣梭子蟹呼腸孤病毒的研宄和防治提供了一個全新的思路，擴大了研宄的范圍，對于實際生產有著極為重要的意義。
【附圖說明】
[0016]圖1為用Mascot軟件進行三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體蛋白質指紋質譜分析，橫坐標表示蛋白質分數，縱坐標表示點擊次數；
圖2為三疣梭子蟹呼腸孤病毒(SCRV)與SCRV受體的結合的免疫共沉淀結果圖；
圖3為體外三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體阻斷試驗中的陰性對照，PBS組；
圖4為體外三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體阻斷試驗中抗受體抗體稀釋10倍組；
圖5為體外三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體阻斷試驗中抗受體抗體稀釋20倍組；
圖6為體外三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體阻斷試驗中抗受體抗體稀釋40倍組。
【具體實施方式】
[0017]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0018]具體實施例一
用蛋白印跡技術篩選三疣梭子蟹呼腸孤病毒受體 1、三疣梭子蟹呼腸孤病毒(SCRV)純化
取攻毒感染死亡的三疣梭子蟹，冰上解剖取其內臟，稱量，按質量體積比Ig:(5-20)ml加入到預先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的TNEgl沖溶液中勻漿，將勻漿液于40C，8000g離心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNEgl沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離心20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于4°C，6000g離心1min后，取上清液于40C，38000g離心1.5h，用預冷的TM2緩沖液洗去沉淀上層疏松部分，取下層結實白色沉