repSpinMiniprepKit小提質粒：將Iml菌液倒入 標記好的I. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3分鐘，離心棄去上清；加250yIBufferP1，混 勻，加250yIBufferP2,迅速輕輕顛倒4-6次；加入350yIBufferN3,顛倒4-6次混勻， 有白色絮狀物析出，13000rpm，4°C，10分鐘；把QIAprepspincolumn放于1.5mlEP管中 (收集廢液）然后將上清移入QIApr印spincolumn中，8000rpm4°C1分鐘；棄去廢液，加 750yIBufferPE，13000rpm，4°C，1 分鐘，棄去廢液，13000rpm，4°C，1 分鐘離心，將QIApr印 spincolumn移入新的1.5ml離心管中，豎直加30ylBufferEB于膜上，放置1分鐘后， 4°C，13000rpm，Imin離心獲得液體單克隆的質粒。測序鑒定正確克隆，即IL21-CD137L細胞 因子質粒。
[0078] (3) IL2細胞因子質粒的制備
[0079] IL2由人工合成獲得TA克隆，IL2基因序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0080] 用SacI和NotI分別消化pCMV載體（質粒載體示意圖見圖1)，IL2合成TA克隆， 消化產物分別進行1%瓊脂糖電泳（TBE電泳緩沖液：Tris108克、Na2EDTA，2H20 7. 44克、 硼酸55克，去離子水定容至1L);切下回收目標片斷和載體至已稱重的1.5mlEP管中，用 QIAEXIIGelExtractionKit純化：加入 3 倍體積的BufferQXl(IOOmg加 300yIQX1)。 加30ylBufferQIAEXII然后50°C水浴10分鐘，期間每兩分鐘漩渦振蕩一次。13000rpm 離心30秒，棄去上清，加500yIQIAEXI洗一次，加BufferPE500y1洗兩次棄去上清， 空氣干燥15分鐘直至沉淀變白。加入20yITE漩渦振蕩30秒培育5分鐘，13000rpm，離心 30秒將上清移入I. 5mlEP管，測量濃度。
[0081] 將酶切純化的pCMV載體片段和IL2基因片段連接，使用T4連接酶試劑盒：按摩爾 數1:3混合pCMV載體片段和IL2基因片段，加入連接酶1U，IOXLigationBuffer2yl， 純化水補足至20y1，16°C反應3小時完成反應，取2. 5y1轉化至DH5a。
[0082] 經轉化的DH5a冰中放置30分鐘，42°C加熱45秒鐘后，再冰中放置1分鐘。加入 LB培養基，37°C振蕩培養60分鐘。取100y1涂在含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養基 上，37°C培養16小時，形成單菌落，挑多個單菌落至2ml含氨芐青霉素LB培養基培養8小 時。
[0083] 將培養8小時的菌液用QIAprepSpinMiniprepKit小提質粒：將Iml菌液倒入 標記好的I. 5ml離心管中，13000rpm，4°C，3分鐘，離心棄去上清；加250yIBufferP1，混 勻，加250yIBufferP2,迅速輕輕顛倒4-6次；加入350yIBufferN3,顛倒4-6次混勻， 有白色絮狀物析出，13000rpm，4°C，10分鐘；把QIAprepspincolumn放于1.5mlEP管中 (收集廢液）然后將上清移入QIApr印spincolumn中，8000rpm4°C1分鐘；棄去廢液，加 750yIBufferPE，13000rpm，4°C，1 分鐘，棄去廢液，13000rpm，4°C，1 分鐘離心，將QIApr印 spincolumn移入新的1.5ml離心管中，豎直加30ylBufferEB于膜上，放置1分鐘后， 4<€，13000印111，11]1；[11離心獲得液體單克隆的質粒。測序鑒定正確克隆，即112細胞因子質 粒。
[0084] 實施例2制備細胞因子顆粒
[0085]取 48yIgag質粒（0?lug/yI)、20y1 細胞因子質粒（0?lug/y1)混合；加 480ylDMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium)培養基充分混勾，加 120yl磷酸 1?轉 染試劑（PolyFectTransfectionKit)混勻，室溫靜止5?10分鐘。293細胞用0?OlMPBS 洗兩遍，0.25%TrypsinEDTA消化后，加完全培養基（DMEM培養基+10%胎牛血清）吹打分 散，計數，75ml培養瓶裝入800萬個細胞并補足培養液終體積9ml，待轉染質粒用3. 6ml完 全培養基稀釋后加入培養瓶，輕拍，使質粒復合體在細胞懸液中充分混勻。37°C、5%C02培 養箱培養6小時，吸去轉染混合液，PBS輕輕洗細胞3遍，加入DMEM培養基繼續培養72小 時。收集上清，用〇. 45umPVDF膜過濾，4°C保存，即含有細胞因子顆粒的液體。
[0086] 鑒定：通過細胞免疫熒光實驗鑒定細胞因子的表達，并應用相應的商品化的細胞 因子標準品和其相應單抗的酶聯免疫反應OD值繪制標準曲線，對所制備細胞因子顆粒進 行定量。實驗步驟如下：
[0087] 用PBS輕輕漂洗細胞3遍，然后加入適量5%甲醛覆蓋細胞，在4°C放置20分鐘； 然后用PBS輕輕漂洗3遍；加入BSA封閉：37°C，室溫保持20分鐘，用PBS輕輕漂洗3遍； 加入相應細胞因子單抗，4°C過夜，或者37°C孵育2小時；PBS輕輕漂洗3遍；加入標記FITC 熒光標記二抗（相應一抗的抗體），37°C孵育30分鐘；PBS輕輕漂洗3遍，熒光顯微鏡下觀 察結果。結果證實實施例1中涉及的細胞因子及共刺激因子在細胞表面表達。
[0088] 用PBS將相應細胞因子單抗配制為濃度2ug/ml，包被至酶標板中，4°C過夜，然后 使用PBS清洗兩遍；細胞因子標準品作十倍系列梯度稀釋后，將梯度標準品和待測細胞因 子顆粒按每孔50y1等體積分別加入酶標板中，37°C孵育2小時；PBS輕輕漂洗1遍；加入 辣根過氧化物酶標記的細胞因子單抗，37°C孵育30分鐘；PBS輕輕漂洗1遍；按每孔50y1 等體積分別加入辣根過氧化物酶底物后，通過酶標儀讀取各孔OD值。
[0089] 將梯度標準品的OD值繪制曲線，計算待測細胞因子顆粒的含量，并將細胞因子顆 粒的濃度調整到與常規細胞因子應用的濃度一致，800IU/ml。
[0090] 實施例3細胞因子顆粒IL15-⑶137L刺激單個核細胞分化和擴增為NK細胞
[0091] 單個核細胞（PBMC)采集：使用（肝素/EDTA)抗凝采集外周血50ml，使用淋巴細 胞分離液（ficol)分離PBMC(單個核細胞），并使用（DMEM/1640/生理鹽水/PBS)洗2遍； 同時收集血漿，56°C滅活30分鐘。
[0092] 培養瓶處理：使用PBS將mAb-⑶16單克隆抗體配置為濃度l-5ug/ml，包被至75cm2 培養瓶，過夜，然后使用生理鹽水清洗兩遍。4°C保存待用。
[0093]T551培養基分為兩組，分別為含細胞因子IL15和⑶137受體的配體蛋白的細胞因 子顆粒IL15-CD137L(800IU/ml)的細胞因子顆粒組和含常規細胞因子IL15和CD137L(各 800IU/ml)的常規細胞因子組。培養條件：溫度：37±0. 5°C、濕度：大于90%、C02濃度： 7. 5±0. 5%〇
[0094] 將上述PBMC計數并分組，按I. 0?9. 9XIO6個/ml密度分別使用上述分組的預 熱的T551培養基（此時配制含5%的自體滅活血漿）重懸PBMC(-般體積為20ml)。重懸 PBMC加入上述處理的培養瓶中，培養3天。
[0095] 第4-14天：根據體積更換容器（無須進行抗體包被處理），根據細胞生長情況大 約每2-3天按1:1比例補充所在組別的T551培養基（此時配制含1%自體滅活血漿）。每 天取樣100y1進行細胞計數，記錄細胞數量（參見表1和圖2)。
[0096] 通過兩組細胞數量變化比較常規細胞因子刺激和細胞因子顆粒刺激的增殖效果， 從表中的數值和統計學檢驗可以看出，第4-14天細胞因子顆粒刺激的的細胞增殖效果顯 著優于常規細胞因子（P〈〇. 05)。
[0097]表I:PBMC增殖細胞計數（IL15-CD137L)
[0098]
【主權項】
1. 一種細胞因子顆粒，其特征在于：所述顆粒包括細胞因子和gag蛋白，優選的，所述 顆粒的表面負載或展示所述細胞因子。
2. 如權利要求1所述的顆粒，所述顆粒通過細胞分泌的方式形成，優選的，所述細胞因 子包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、生長因子和/或趨化性細胞因 子，更優選的，所述細胞因子是白細胞介素。
3. 如權利要求1-2任一所述的顆粒，所述顆粒還包括共刺激分子。
4. 一種表達載體系統，其特征在于：包括：（1)包含重組蛋白gag基因的載體和（2)包 含細胞因子基因的載體，優選的，所述細胞因子包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集 落刺激因子、生長因子和/或趨化性細胞因子，更優選的，所述細胞因子是白細胞介素。
5. 如權利要求4所述的表達載體系統，其特征在于：還包括共刺激分子基因。
6. -種宿主細胞，其特征在于：包含權利要求4-5任一所述的表達載體系統。
7. -種權利要求1-3任一所述的顆粒的制備方法，其特征在于：將權利要求6所述的 宿主細胞在合適的條件下表達。
8. 權利要求1-3任一所述的顆粒在制備刺激單個核細胞分化和擴增試劑中的用途。
9. 權利要求1-3任一所述的顆粒在刺激單個核細胞分化和擴增中的用途。
10. -種刺激單個核細胞分化和擴增的方法，使用權利要求1-3任一所述的顆粒體外 刺激單個核細胞。
【專利摘要】本發明提供一種細胞因子顆粒及其應用，其包括細胞因子顆粒制作方法，所述的顆粒包含一個或多個細胞因子以及重組蛋白gag形成的顆粒；以及細胞因子顆粒體外刺激單個核細胞分化的方法，其中包括細胞因子顆粒體外刺激單個核細胞分化為NK細胞或T細胞并擴增其數量。細胞因子顆粒比細胞因子刺激作用更強，效果顯著。
【IPC分類】C12N5-0783, C12N15-85, C07K14-475, C07K14-52
【公開號】CN104610442
【申請號】CN201510048164
【發明人】張永輝, 林小靖
【申請人】張永輝, 林小靖
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月30日