檢測pik3ca基因h點突變的pcr-rflp方法

檢測pik3ca基因h點突變的pcr-rflp方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測PIK3CA基因H1047R位點突變的PCR-RFLP 方法。
【背景技術】
[0002]磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是使磷脂酰肌醇分子中肌醇環的3位羥基磷酸化的酶，其所調控的信號通路涉及細胞增殖、粘附、生存等多種生命活動，在腫瘤發生發展中起重要作用。PIK3CA基因編碼PI3K的催化亞基，可以激活PI3K通路的下游AKT途徑。PIK3CA的突變與大腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發生密切相關。研究發現，在大腸癌中，PIK3CA的突變熱點集中于E542K、E545K和H1047R。近期研究顯示，位于外顯子20的H1047R點突變與轉移性大腸癌的抗表皮生長因子受體EGFR的靶向治療療效相關，攜帶該突變的患者無法從抗EGFR靶向治療中獲益，PIK3CA H1047R突變有可能繼KRAS G12V突變和BRAFV600E突變之后，成為大腸癌靶向治療的又一療效預測因子。因此，發展針對該位點的高效基因突變檢測方法對于準確預測靶向治療的適用人群，提高治療效果，避免患者不必要的治療費用和毒副作用，進行個體化的治療，具有重要意義。
[0003]目前，DNA直接測序是PIK3CA基因突變檢測的金標準，但該方法的檢測靈敏度較低，通常只有20%-30%，難以檢測出樣品中低豐度的基因突變，易造成用藥人群的錯誤分類，導致治療無效。此外，DNA直接測序方法操作繁瑣、耗時。近年，有研究建立HRM高分辨熔解曲線方法檢測PIK3CA的H1047R突變，一定程度提高了檢測靈敏度，但較高的檢測費用和特殊的設備要求限制了其廣泛的臨床應用。
[0004]PCR-RFLP稱為聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析，是一種成熟的基因突變檢測方法。通過內切酶特異性識別并切割野生型與突變體DNA的差異堿基位點，電泳分離酶切片段，根據片段長度和數量的差異判斷突變的存在，特別適合對基因點突變的檢測。由于該方法特異性強，結果容易判斷，操作簡單，已被廣泛應用。相對于DNA直接測序，該方法具有更高的檢測靈敏度；相對于HRM等以峰型差異判斷結果的方法，該方法具有更高的檢測準確性，并且沒有復雜的設備要求，檢測費用相對較低，適合臨床的實際應用，但目前未見采用該方法進行PIK3CA基因突變檢測的報道。為此，本發明開發一種針對PIK3CA基因H1047R突變位點的PCR-RFLP檢測方法，用于指導和監控腫瘤的個體化治療。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種用于PIK3CA基因H1047R位點突變的檢測方法。發明要點在于針對PIK3CA基因H1047R突變位點設計一對特異性引物，引入Fst I限制性酶切位點，使野生型和突變型PIKACA基因片段形成差異性限制性酶切圖譜，分析H1047R位點突變狀態，用于指導腫瘤個體化治療。
[0006]本發明檢測PIK3CA基因H1047R位點突變的PCR-RFLP方法包括以下步驟:
1.提取待檢樣品的基因組DNA 2.PIK3CA基因的PCR擴增
以提取的基因組DNA為模板，使用上游引物5’ -GGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCG-3 ’ 和下游引物 5 ’ -GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTT-3 ’，進行 PCR 擴增，得到126bp擴增產物，同時引入Fst I酶切位點；
3.Fst I酶切反應
以擴增得到的126bp產物為模板，使用Fst I內切酶進行酶切反應；
4.電泳檢測酶切片段
采用瓊脂糖凝膠電泳方法分離酶切片段，獲得限制性片段長度多態性圖譜；
5.突變狀態結果判定
根據限制性片段的長度和數量確定待檢樣品的PIK3CA基因突變狀態，電泳圖譜在96bp和30bp位置呈現兩條帶者判定為PIK3CA基因野生型；電泳圖譜中在126bp處呈現一條帶者判定為突變型。
[0007]所述的待檢樣品包括細胞系、新鮮組織、石蠟切片、血液標本或糞便；所述的待檢樣品的基因組DNA，使用商品化的DNA提取試劑盒提取獲得。
[0008]所述的PIK3CA基因PCR擴增體系如下: ddH2017 μ? 1Xbuffer (含 Mg2+) 2.5 μ?
dNTP2 μ?
上游引物(ΙΟμΜ) I μ? 下游引物(ΙΟμΜ) I μ? 基因組DNAI μ?
rTaq0.5 ?
總體積25 μ?
所述的PCR擴增條件為:
預變性:94°C 5 min ;30個循環:變性94°C 45 s，退火60°C 45 s，延伸72°C 45 s ;最后延伸72°C 5 min。
[0009]所述的Fst I酶切反應體系及條件如下: ddH205 μ?
1X FastDigest Buffer I ? PCR 產物(200ng) 2 μ? FastDigest enzyme (Fst I ) 2 M-L 37 °C 孵育 10 min。
[0010]所述的電泳檢測酶切片段采用瓊脂糖凝膠電泳，使用3%瓊脂糖凝膠，10 PL酶切產物上樣，5 μ? DL500作為分子量標準對照，95V條件下進行電泳分離。EB染色，凝膠成像系統觀察拍照。
[0011]所述的突變狀態結果判定方法為:電泳圖譜在96bp和30bp位置呈現兩條帶者判定為PIK3CA基因野生型，即含有I個Fst I酶切位點；電泳圖譜中在126bp處呈現一條帶者判定為突變型，即不含Fst I酶切位點。
[0012]本發明的優點及有益效果如下: 1.與DNA直接測序法相比，操作簡單，樣品用量小，靈敏度高。以瓊脂糖凝膠作為電泳基質，EB染色顯示電泳條帶，本發明對突變DNA的檢測靈敏度可達0.5%。采用本發明進行60例大腸癌患者腫瘤組織石蠟切片的PIK3CA基因突變狀態檢測，突變檢出率為20%,明顯高于DNA直接測序法的10%。本發明如采用聚丙烯酰胺凝膠作為基質，銀染顯示電泳條帶，其靈敏度可進一步提聞。
[0013]2.本發明根據酶切產生的特異性片段圖譜判定突變的存在，與HRM等采用峰型判斷結果的方法相比，具有更好的檢測重現性和準確性，采用本發明檢測60例大腸癌患者腫瘤組織石蠟切片的PIK3CA基因突變狀態，檢出12例存在突變，其突變狀態全部與DNA直接測序或克隆測序檢測結果一致。
[0014]3.與DNA測序、HRM、熒光定量PCR等方法相比，本發明不需要復雜、昂貴的設備，在普通的分子生物學實驗室即可方便完成檢測。
[0015]4.本發明的檢測靈敏度可通過將電泳環節移植到微流控芯片等平臺上，得到進一步的提聞。
[0016]5.可與已報道的針對KRAS、BRAF基因點突變的PCR-RFLP方法聯合應用，使與個性化治療相關的多個基因能夠在相同的、更高的檢測靈敏度下同時檢測，提高個性化用藥的準確性。
[0017]6.本發明適合多種檢測對象的分析，包括細胞系、新鮮組織標本、石蠟切片、血液、
糞便等。
【附圖說明】
[0018]圖1為PCR-RFLP檢測大腸癌細胞中PIK3CA基因H1047R位點突變狀態電泳圖。
[0019]圖2為PCR-RFLP檢測大腸癌患者腫瘤組織石蠟切片標本中PIK3CA基因H1047R位點突變狀態電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0021]實施例1
本發明PCR-RFLP方法檢測大腸癌細胞中PIK3CA基因H1047R位點突變包括下述步驟:
(1)提取樣品的基因組DNA
分別取處于對數生長期的人大腸癌細胞系SW620和LS174T，胰蛋白酶消化后，計數細胞。取細胞I X 16個，1000 rpm離心5 min,棄上清；依照Promega全基因組提取試劑盒的操作步驟提取細胞基因組DNA ;提取的DNA溶入20 μ L ddH20，在260 nm波長下測定并調整濃度為0.5 μΒ/μ? ；
(2)PIK3CA基因的PCR擴增
以提取的基因組DNA約100 ng為模板，使用上游引物5’-GGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCG-3’和下游引物 5’-GAGCTTTCATTTTCTCAGTTATCTT-3’，進行 PCR 擴增，得到 126bp 擴增產物；
PCR反應總體積為25 PL，組成成分為: ddH2017 μ? 1Xbuffer (含 Mg2+) 2.5 μ? dNTP2 μ?
上游引物(ΙΟμΜ) I