豬初生重性狀相關plac1基因分子標記的克隆及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于豬分子標記制備技術領域，具體涉及一種與豬初生重性狀相關PLAC1 基因分子標記的克隆及應用。所述的分子標記從豬PLAC1基因中克隆得到，它包括豬PLAC1 基因編碼區序列突變位點的檢測方法與應用。
【背景技術】
[0002] 在養豬生產過程中，如何達到使母豬多產以及仔豬多活、快長從而提高生產性能、 降低生產成本成了養豬生產者關注的焦點，因此豬繁殖性狀越來越受到人們的重視。
[0003] 豬的初生重作為一個重要的繁殖性狀，對豬出生后的生長速度及成活率具有重要 的作用。最近有很多文獻報道了初生重對豬出生后生長速度的影響。Beaulieu等（Beaulieu AD等，Impactofpigletbirthweight,birthorderandlittersizeonsubsequent growthperformance,carcassquality,musclecompositionandeatingqualityof pork[J].JAnimSci. 2010)和Poore等（PooreK.R?等，Theeffectsofbirthweight andpostnatalgrowthpatternsonfatdepthandplasmaleptinconcentrationsin juvenileandadultpigs.J.Physiol. 2004)研宄發現，初生重較低的豬生長速度較慢，從 而使其進入市場的時間增加。另有研宄表明仔豬的初生重與育成率亦悉悉相關，初生重在 1.OKg以下時仔豬育成率隨著初生重的增加而上升；初生重在1.OKg以上時仔豬育成率沒 有明顯的規律。初生重小于等于〇.5Kg時仔豬育成率僅為55. 56% (高建國.二花臉豬初生 重對出生后生長速度及育成率的影響[J].畜牧與獸醫，1992,24(1) :26)，G〇ndret，F.L.等 (Gondret,F.L?等，Lowbirthweightisassociatedwithenlargedmusclefiberarea andimpairedmeattendesnessofthelongissimusmuscleinpigs.J.Anim.Sci. 2006) 和Wolter等（Wolter,B.F?等Theeffectofbirthweightandfeedingofsupplement milkreplacertopigletsduringlactationonpreweaningandpostweaninggrowth performanceandcarcasscharacteristic.J.Anim.Sci. 2002)研宄報道稱，豬出生重與 出生后早期的生長速度相關，初生重小的胎兒初生重大的胎兒更虛弱，出生后需要更好地 環境條件來保證它的存活。
[0004] 胎盤是保證胎兒健康發育的重要場所，母體營養物質都要通過胎盤轉運給胎兒。 豬胎盤是上皮絨毛膜型胎盤，胎兒側的胎盤滋養層上皮不會嵌入母體子宮內膜基質內，而 是與子宮腔上皮相互粘附，并隨著妊娠的進行形成裙皺（Miles,J.R.等Molecularcloning andcharacterisationofheparanasemRNAintheporcineplacentathroughout gestation.ReprodFertilDev. 2009)。胎盤裙皺的形成與發育可以大大增加母體與胎兒 營養物質交換的面積，即增加胎盤傳輸營養物質的效率（Vallet，J.等Developmentofthe pigplacenta.SocReprodFertilSuppl.2009 ;Linjun,H?等ExpressionofHeparanase IsAssociatedwithBreed-SpecificMorphologicalCharactersofPlacentalFolded BilayerBetweenYorkshireandMeishanPigs.BiolReprod. 2014)，而充足的營養物質 是保證胎兒健康發育的基礎，營養物質供給不足會導致胎兒發育遲緩，并降低胎兒的初生 重，嚴重者甚至會導致胎兒死亡。因此胎盤褶皺的形成與發育對胎兒初生重具有重要影響。
[0005] PLAC1基因是在人、小鼠等哺乳動物胎盤中特異表達的基因，近期的研宄表明 PLAC1基因在妊娠過程中對胎盤滋養層上皮細胞的迀移、運動具有重要作用（Wen-Lin，C. 等Roleofplacenta-specificprotein1inthetrophoblastsinvasionand migration.Reproduction. 2014)，從而增大滋養層與母體子宮接觸的面積，增加營養物質 的運輸，有利于胎兒健康發育。另外有研宄發現，敲除PLAC1基因會導致胎盤肥大和胎兒宮 內發育遲緩（IUGR)，胎兒往往于妊娠后期或分娩后不久死亡，說明PLAC1基因是正常的胎 盤和胚胎發育所必需的（Jackman,S.M?等Placl(Placenta-specific1)IsEssentialfor NormalPlacentalandEmbryonicDevelopment.MolReprodDev. 2012)〇
[0006] 常規的育種技術對豬繁殖性狀的改良進展緩慢，效果不明顯，而且選擇過程花費 時間長，耗費資金多，準確性有待提高（Linville，R.C.等Candidategeneanalysisfor lociaffectinglittersizeandovulationrateinswine.JAnimSci. 2001) 〇 分子 生物學技術的迅速發展使得豬的育種工作出現了新的曙光，目前，標記輔助選擇（MAS)已 經成功應用到國內外的豬育種實踐中，取得了巨大的經濟效益，憑借這一技術手段，育種工 作者們發掘出了一大批與豬的初生重，生長速度，斷奶重，產仔數等重要的繁殖性狀有著顯 著關聯的分子標記。這為提高豬的生產性能提供了理論依據，并從實質上使之得到了很大 的提尚。
[0007] 鑒于PLAC1基因在妊娠過程中對胎盤滋養層上皮細胞的迀移發揮重要作用，我們 認為它很可能在豬妊娠過程中對胎盤滋養層上皮細胞參與形成胎盤褶皺發揮著重要作用， 進而影響豬胎盤對營養物質的運輸效率，從而對胎兒初生重具有重要影響。研宄基因突變 位點在群體中的多態性，并對其進行性狀關聯分析是研宄基因功能的一個非常有力的手 段，所以申請人對這個基因進行了多態性研宄和關聯分析，以期能夠發現它對豬繁殖性狀 的影響。
【發明內容】
[0008] 發明的目的在于獲得一種與豬初生重性狀相關的分子標記，克隆PLAC1基因編碼 區序列，尋找突變位點以及基因多態性的檢測方法，為豬初生重性狀檢測提供一種分子標 記和方法。
[0009] 本發明的技術方案如下：
[0010] 一種分子標記Hhal-RFLP在豬初生重性狀關聯分析中的應用，其步驟如下所述：
[0011] 1)用人PLAC1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性高的表達序 列標簽（EST)，然后對EST進行拼接；提取豬妊娠95天胎盤組織總RNA并做cDNA第一鏈 反轉錄；設計引物對，該引物對的正向引物為5 ' -TCCTCTTCCGCCAATCCC-3 '，反向引物為 5' -GCCATCAGAAAITTAmTCTCTC-3'（見序列表SEQIDNO:5,6)，用RT-PCR方法擴增豬 PLAC1基因的cDNA片段，PCR產物純化克隆和測序，通過序列分析獲得如SEQIDN0:2所示 的核苷酸序列（即cDNA序列）；
[0012] 2)根據SEQIDNO:2所示的核苷酸序列設計引物對，該引物對的核 苷酸序列如下所示：正向引物-CTGCTACGACGTGTTCACCTT-3 '，反向引物： 5 ' -AGCACAGGCTACCCATAAGAG-3 '(見序列表SEQIDNO:3,4)，擴增豬基因組DNA，將PCR 產物純化克隆和測序，通過序列分析獲得如下所述的核苷酸序列：
[0013] CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTC TTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTC CTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGG GGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGT AGCCTGTGCT
[0014] 上述序列中的R是C或T，導致Hhal-RFLP多態性；
[0015] 3)檢測目的基因PLAClmRNA在豬胎盤的絨毛膜組織樣中轉錄水平的表達，設計用 于檢測目的基因PLAClmRNA表達水平的引物對以及作為內參基因GAPDH的引物對，其核苷 酸序列分別如下所示：
[0016] 擴增目的基因PLAC1的引物對：
[0017] 正向引物：5'GAAACCTCCACCAGACAGC3'，（見序列表SEQIDNO:7)
[0018] 反向引物：5'CCGTGACCATGAGCCAGT3'，（見序列表SEQIDNO:8)
[0019] 擴增內參基因GAPDH的引物對的DNA序列如下：
[0020] 正向引物：5'CACCAGGGCTGCTITTAACTCTG3'，（見序列表SEQIDNO:9)
[0021] 反向引物：5'GATGACAAGCTTCCCGITCTCC3' ；（見序列表SEQIDN0:10)
[0022] 4)PLAC1基因組織表達譜分析；
[0023] 5)定位PLAC1基因的mRNA在豬胎盤組織的表達位置；
[0024] 6)應用PCR-RFLP方法對序列表SEQIDNO: 1的第73位堿基進行檢測，然后進行 基因型與豬初生重性狀的關聯分析。
[0025] SNP發現與檢測方法建立：申請人設計了擴增包含該SNP的引物，經分析T/C位點 的突變可以采用Hhal進行酶切檢測多態性。在擴增的302bp的片段上，存在一個Hhal的酶 切位點，電泳檢測結果顯示在PLAC1基因的T/C位點存在3中基因型，CC型（228bp、74bp)， TC型（302bp、228bp、74bp)，TT型（302bp)。酶切電泳結果證實了PLAC1基因CDS區該突變 位點的存在。
[0026] 同時通過熒光定量PCR檢測了PLAC1基因在大白豬妊娠的第26天、50天和95天胎 盤組織樣中轉錄水平的表達情況，結果表明（如圖3所述），PLAC1基因在胎盤褶皺形成初 期（妊娠26天）表達量較低，隨著妊娠的進行，表達量逐漸增高，在妊娠末期（妊娠95天） 仍具有較高的表達量。組織表達譜結果表明PLAC1基因只在豬胎盤組織中特異表達（如圖 4所述）。另外通過原位雜交實驗表明PLAC1基因mRNA只在胎盤滋養層上皮細胞中表達， 在胎盤基質細胞以及子宮中都不表達，其雜交模式在梅山與大白豬中沒有顯著區別（圖5 所示）。由雜交信號的強弱程度可以看出，在妊娠26天，PLAC1基因mRNA的雜交信號較弱， 表明其表達量較低，而在妊娠50天和95天雜交信號都很強，表明其表達量在這兩個時期都 很強，這與定量的結果相一致。PLAC1基因在豬胎盤組織中的時期特異性表達說明其在胎盤 發育及功能中有重要作用，很可能與促進豬胎盤褶皺的發育有關。
【附圖說明】
[0027] 序列表SEQIDNO:1是本發明制備的分子標記的核苷酸序列，序列全長為302bp， 在該序列的第73bp處有一個C/T突變，該突變導致Hhal-RFLP多態性（其中序列表SEQID NO:1中73bp處的堿基已經由C突變為T)。
[0028] 序列表SEQIDNO:2是擴增的PLAC1基因的cDNA序列，序列全長為1106bp。
[0029] 序列表SEQIDNO:3-10是設計的引物序列（這些引物序列與說明書正文中的序 列說明是一致的）。
[0030] 圖1 :是本發明PLAC1基因的分子標記的制備流程圖。
[0031] 圖2 :本發明中豬PLAC1基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段，即本發明制備的分 子標記（下劃線部分為引物