運用比較基因組學快速鑒定菜豆抗白粉病基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明是借助于菜豆測序全基因組序列，利用植物比較基因組學、遺傳學、生物信 息學和候選基因策略等方法快速鑒定菜豆白粉病基因，主要涉及到菜豆全基因組序列的下 載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術 科學領域。
【背景技術】
[0002] 菜豆是人類主要的食用豆類作物，占全球食用豆類總產量的50%，是植物蛋白的 主要來源之一。菜豆白粉病在我國各地普遍發生，是生產中的主要病害，每年造成的產量 損失高達30 %，嚴重時甚至高達80 %。目前在生產中，噴灑殺菌劑和推廣抗病品種是主要 的防治方法，但長期使用藥物會導致環境污染和病菌生理小種變異，因此推廣抗病品種是 最安全有效的方法。目前國內菜豆育種相對落后，生產中使用的抗病品種還主要依賴進 口。菜豆屬嚴格自交作物，其花器官的特殊構造導致一般的雜交、回交等語種手段在菜豆 上很難進行，因此利用常規育種方法選育抗病品種顯得非常困難。挖掘抗病基因，利用生 物工程創新種質成為下一步人們研究的重點。菜豆白粉病由半知菌亞門的粉孢屬（Oidium spp.)侵染所致。病菌有性階段歸子囊菌亞門的多囊絲殼屬（Erysiphespp)或單囊絲殼屬 (Sphaerothecaspp.)，但有關菜豆白粉病菌種分化以及其抗性遺傳規律的研究資料較少， 目前尚無文獻報道，這嚴重阻礙了菜豆白粉病研究的步伐。
[0003] ML0是植物特有的一類抗病基因，是人們發現的第一個抗病基因。人類最早發現 ML0基因是在大麥中，人們在研究中發現這種基因在抗白粉病品種中沒有功能，將擬其沉默 使其不發揮功能時，該品種能對白粉病產生抗性。ML0對植物的抗病過程起負調控作用，在 一定程度上相當于植物的"感病"基因，它的突變或缺失能夠發生類似非寄主的識別反應， 導致植物產生對病原菌所有已知小種的廣譜抗性。因此，這類基因在改善植物抗性方面具 有很大的潛力和應用前景。最近，研究發現番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等很多植 物的白粉病基因都是ML0型抗病基因控制。因此挖掘植物中的ML0型抗病基因對植物抗白 粉病育種具有重要的意義。已有的研究表明，ML0基因在許多作物里呈家族形式，具有多個 家族成員，其中擬南芥中有15個家族成員。在玉米中發現至少有9個。在水稻中有12個 家族成員，由于其他植物的全基因組測序上作的滯后等因素，在大麥，小麥、蓮藕、辣椒、番 茄等作物上相對很少有ML0家族其它成員被發現。
[0004]目前，克隆植物抗病基因的方法主要有轉座子標簽法、圖位克隆法等。但是由于菜 豆的基礎研究不夠深入，因此利用這些方法很難準確地克隆這些基因。因此，如何快速鑒定 菜豆中的ML0型抗病基因將成為菜豆抗白粉病育種的重要前提。最近，菜豆基因組測序的 完成為我們快速挖掘菜豆白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以菜豆全基因組序列為前 提，結合遺傳學、基因組學和生物信息學等知識，快速挖掘白粉病基因的方法。
[0005] ML0型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發現ML0(Mildew resistance locus2)基因對白粉病抗性是始于1937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.hordei)所有已 知的生理小種都具有高效抗性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大 麥對幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發現很多 植物的抗白粉病基因都是ML0型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等等。 因此挖掘植物中的ML0型抗病基因對植物抗白粉病育種具有重要的作用。
[0006]目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉座子標簽等方法。但是由于菜 豆的基礎研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定菜豆中的ML0型抗病基因將成為菜豆抗白粉病育種的重要前提。
[0007] 植物比較基因組學（ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序基礎上，對 已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利 用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆其他植物基 因，揭示基因功能和分子機制，闡明物種進化關系及基因組的內在結構。本專利所采用的方 法及思路：模式植物擬南芥基因組研究已經揭示了ML0型基因的功能，利用基因其順序上 的同源性克隆菜豆ML0型抗病基因，根據模式植物擬南芥實驗系統上的優越性和已知ML0 型抗病基因的特點，快速"捕捉"菜豆抗白粉病基因。本專利介紹了以菜豆全基因組序列為 前提，結合比較基因組學、遺傳學、基因組學、生物信息學和候選基因策略等知識，快速挖掘 白粉病基因。
【發明內容】
[0008] 技術問題
[0009] 本發明的目的是提供一種通過結合植物比較基因組學、植物遺傳學、基因組學和 生物信息學等知識，快速挖掘菜豆抗白粉病基因。其結果一方面可用于菜豆白粉病基因緊 密連鎖分子標記的開發，進行分子標記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據。
[0010] 技術方案
[0011] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（ML0)是從大麥中克隆的，研究發現此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數NBS(nucleotide-bindingsite)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發現這些基因編碼的都是ML0型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實ML0 型抗病基因已經成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發現，植物ML0類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的ML0基因家族進行系統發育關系分析發現，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類ML0基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。菜豆基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經測序的菜豆全基因組中ML0基因家族和已經克隆的ML0白粉病基因的系統發育關 系以及對于維持白粉病基因ML0重要功能的氨基酸保守性來鑒定菜豆白粉病基因。
[0012] 主要步驟如下：
[0013] 1)菜豆全基因組序列的下載及其ML0型基因的采集
[0014]首先從菜豆測序基因組數據庫（http://www.phytozome.net/search.php)下 載菜豆全基因組序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的菜豆全基因組氨基酸序列數據建 立數據庫，然后用pfam數據庫（蛋白家族數據庫，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾可夫模型（HMM)對MLO結構域的氨基酸序列與已建立的菜豆全基因 組氨基酸序列數據庫進行Blastp(E-valUe=0. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。 其次，利用已經公布的ML0型基因序列，對菜豆基因組數據庫進行BLAST比對，獲得候選基 因序列。
[0015] 2)菜豆ML0型基因家族的鑒定
[0016] 將上述結果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-valUe=1.0)進行 分析，去除無'ML0'結構域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件 提供的ClustalW工具（多序列比對程序）進行多序列比對，去除重復序列。
[0017] 3)通過植物ML0型基因的系統發育關系鑒定候選的菜豆ML0型白粉病基因
[0018] 由于先前的研究已經證明，雙子葉植物ML0型白粉病基因位于植物ML0基因系統 發育樹同一區組，因此在系統發育關系研究中，我們把擬南芥的ML0型基因家族和一些其 他作物的ML0型抗白粉病基因和菜豆ML0型基因一起聚類分析，以獲得候選的菜豆抗白粉 病基因（圖2)。
[0019] 4)菜豆白粉病基因與已知的植物ML0白粉病基因的比對
[0020] 利用Bi〇XM2. 6軟件將菜豆候選的ML0型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的 ML0白粉病基因的氨基酸序列轉換成Fasta格式的文件，將這些文件導入Bi〇Edit7. 0軟件， 運用此軟件中Clustal軟件進行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區域 的保守性。從而進一步鑒定菜豆候選的白粉病基因（圖3)。
[0021] 本發明的積極效果：
[0022] 1)縮短了菜豆白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規方 法（圖位克隆、轉座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發明基于植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學方法快速挖掘菜豆白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0023] 2)菜豆（Phaseolusvulgaris)屬于蝶形花科菜豆屬，是全世界廣泛種植的重 要蔬菜作物之一。由于菜豆遺傳基礎狹窄，種質資源多樣性低，因此通過常規的分子標記 (RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定菜豆白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開 發相應的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選 擇，進行多抗性育種材料的創制，可以縮短育種年限，提高育種效率。
[0024] 3)為闡述菜豆抗白粉病分子機制奠定了基礎。菜豆抗白粉病基因的鑒定，通過轉 基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS)技術等研究 抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述菜豆抗白粉病的作用機理。
【附圖說明】
[0025] 圖1菜豆ML0基因的鑒定；
[0026] 本圖顯示的是19個ML0型基因鑒定結果，每一個基因都含有一個'ML0'保守結構 域。
[0027] 圖2植物ML0基因家族的系統發育關系分析及其菜豆ML0型白粉病基因的鑒定；
[0028] 擬南芥是植物科學研究的模式植物，在構建系統發育樹中，擬南芥的15個ML0型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002,AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (S1ML0)、大麥白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 菜豆ML0型基因聚類分析。共鑒定出6個菜豆候選的ML0型白粉病基因。圖中紅色標記的 基因就是候選菜豆白粉病基因。
[0029] 圖3菜豆ML0型白粉病基因的比對分析；
[0030] 6個菜豆白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（S1ML0)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002,AtML006和AtML012)進行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區域的保守型。圖中TM1-TM7表示菜豆ML0型白粉病基因的7個轉模區域；黑色圓點表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調蛋白結合區；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區域。
【具體實施方式】
[0031] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出菜豆白粉病基因。具體實施過程如下：
[0032] 1)菜豆ML0型基因的采集
[0033] 為了獲得菜豆全部的ML0型基因家族成員，我們首先以擬南芥的ML0型基因，番 茄、豌豆、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病ML0基因序列構建HMM模型，從菜豆基因組序列中 收索ML0型基因；其次以不同作物中已經發表的ML0基因序列作為靶序列（來自DFCI數 據庫：TC171015,TC267529,DFCI:TC327983,TC289653,TC312087,TC132500,TC133436， TC317623,TC317025,TC315947,TC325903,TC315944,TC315912,TC322759,TC322059, TC330654,TC282713,TC293173,TC281861,TC283253,TC283383,TC285032,TC290021, TC302716,TC283487,TC282866,TC283441，TC281428,TC285118,TC285090 ;來自GenBank數 據庫：AY967408,AF384145,AF384144,AY029312-AY029315,AY029317-AY029319,Z95352， AF369563