在畢赤酵母中使用甲醛脫氫酶啟動子指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白l1表達的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種在甲醇營養型畢赤酵母宿主細胞 中使用畢赤酵母甲醛脫氫酶（FLD)啟動子指導人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白LI(HPV 16L1)表達的方法。
【背景技術】
[0002] 畢赤酵母表達系統能有效地分泌異源蛋白，并進行真核翻譯后修飾，操作簡便易 于實現高密度發酵，且不產生內毒素及哺乳動物細胞核酸成分等，因此，是一個廣泛應用的 蛋白表達系統。轉錄是基因表達調控最關鍵的環節之一，啟動子可顯著影響異源基因轉錄 的起始、水平及持續，從而直接影響異源蛋白的表達效率。畢赤酵母中最常用、最經典的啟 動子是醇氧化酶1型啟動子(AOX1)，該啟動子具有嚴格的甲醇調控能力，使用畢赤酵母醇 氧化酶1型啟動子已成功指導了上百種重組蛋白的表達。盡管醇氧化酶1型啟動子能夠指 導異源蛋白大量表達，但由于甲醇有毒且易燃，為安全和大規模生產帶來問題，同時并不是 所有異源蛋白都適合這樣高水平的表達調控，如果蛋白的正確折疊和加工是蛋白分泌途徑 上的限速步驟，那么單位時間內大量表達的異源蛋白由于來不及進行修飾折疊，最終導致 這些未成熟的蛋白進入泛素化降解途徑，相反地使蛋白產量降低。
[0003] 因此避免甲醇的使用尋找另一些替代的啟動子則是一個有效的策略。畢赤酵母甘 油醛3-磷酸脫氫酶啟動子（GAP)是另一個常用的畢赤酵母啟動子，該啟動子屬于組成型啟 動子，無需誘導，對于無毒性蛋白的表達具有簡便、經濟的優勢。
[0004] 盡管組成型啟動子簡化了生產步驟，但若獲得較高的蛋白產量，對菌體的生長狀 況要求較高，并且其調控途徑比較單一，蛋白表達的種類受限。因此一個強的具備多種調控 途徑的啟動子具有很好的開發應用價值，對于異源蛋白的表達研宄具有重要意義。
[0005] 在畢赤酵母中，谷胱甘肽依賴的甲醛脫氫酶（FLD)啟動子就是一個具備多種調控 途徑的啟動子。甲醛脫氫酶是參與酵母甲醇代謝和烷胺類物質代謝途徑的主要酶。從畢赤 酵母中分離得到的甲醛脫氫酶基因編碼379個氨基酸，與n-烷烴-同化酵母麥芽糖假絲 酵母的甲醛脫氫酶和人類及其它真核生物的脫氫酶III類酶的甲醛脫氫酶分別具有71%和 61%?65%的核苷酸序列同源性。甲醛脫氫酶將醇氧化酶氧化甲醇產物甲醛氧化，甲醛氧化 產物經甲酸脫氫酶后變為二氧化碳。甲醛脫氫酶同時參與烷胺類物質代謝，胺類物經胺類 氧化酶氧化形成甲醛，之后經甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶87作用后，產生二氧化碳并同化為 生物量。甲醛脫氫酶的合成可以獨立地被以甲醇作為唯一碳源和能源，或以甲胺作為唯一 氮源調控。在葡萄糖和銨鹽離子培養基中，甲醛脫氫酶表達水平很低；然而在甲醇-銨離子 或葡萄糖-甲胺培養基中，甲醛脫氫酶表達水平卻很高。
[0006] 甲醛脫氫酶啟動子已成功用于一些蛋白在畢赤酵母中的表達。使用甲醛脫氫酶啟 動子可以使成熟形式的米根霉脂肪酶獲得高水平的表達量，最大產量達386AU/ml，克服了 醇氧化酶1型啟動子指導的米根霉脂肪酶的過表達對細胞生長帶來的負效應，突破了米根 霉脂肪酶的分泌瓶頸。使用甲醇作為碳源和甲胺作為氮源的組合對蛋白產量具有協同增強 效應，而甲醇和硫酸銨碳氮源組合培養基則顯示出最好的表達能力，在發酵培養基中表達 米根霉脂肪酶可達到300WT1的產量。然而甲胺作為氮源，當同作為碳源的山梨醇組合使用 時也能很好地誘導米根霉脂肪酶的表達。研宄表明，無論是以甲醇或是甲胺進行誘導，甲醛 脫氫酶啟動子的強度均不弱于畢赤酵母醇氧化酶1型啟動子。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種在甲醇營養型畢赤酵母中使 用甲醛脫氫酶啟動子調控人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1表達的方法，其中人乳頭瘤 病毒16型主要衣殼蛋白L1的表達受畢赤酵母甲醛脫氫酶啟動子的控制。
[0008] 本發明采用的技術方案如下： 畢赤酵母甲醛脫氫酶啟動子指導的畢赤酵母表達載體的構建方法，包括如下步驟： 步驟（1)，將甲醛脫氫酶啟動子基因片段進行PCR擴增，擴增后的基因片段純化后，亞 克隆進TA克隆載體pMD?18-T，得到Z^m-pMDTmIS-T載體； 所述的PCR擴增引物為：上游引物（5'端）為gtagatctgcatgcaggaatctctggca，下游引 物（3> 端）為gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga; 步驟（2 )，將步驟（1)得到的Z^m-pMDTmIS-T載體和畢赤酵母質粒pPink-HC進行雙酶切， 連接酶連接過夜，得到質粒pPinkFLD-HC; 步驟（3)，將步驟（2)得到的質粒pPinkFLD-HC和畢赤酵母質粒pPinkAOXl-HPV16Ll進 行雙酶切，連接酶連接過夜，得到連接產物質粒pPinkFLD-HPV16Ll; 步驟（4)，步驟（3)得到的連接產物質粒pPinkFLD-HPV16Ll轉化大腸桿菌DH5a擴增 后，用限制性內切酶I酶切，純化回收酶切線性化質粒； 步驟（5 )，將步驟（4 )得到的純化回收的酶切線性化質粒電轉化畢赤酵母PichiaPink^^trai/? /感受態細胞，經過畢赤酵母腺嘌呤缺陷平板篩選得到質粒 pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子。
[0009] 進一步，優選的是所述的PCR擴增的反應體系包括2微升lOXExtaq酶緩沖液， 1. 6微升dNTP混合物，50微摩爾濃度的上、下游引物各0. 25微升，0. 5微升Extaq酶，2微 升畢赤酵母細胞系GS115菌液，雙蒸水13. 4微升； 所述的PCR擴增反應條件為95 °C，預變性3分鐘；72 °C，熱啟動2分鐘，同時，向反應體 系中加入高保真taq酶；之后95°C，變性30秒；52°C，退火40秒；72°C，延伸1分鐘；最后 72 °C，再延伸10分鐘，共34個循環。
[0010] 進一步，優選的是步驟（2)的具體操作如下：用限制性內切酶ifejn和 ifeal(+fe〇RI)雙酶切步驟（1)得到的/^-pMDTM18-T載體后所得甲醛脫氫酶啟動子片 段PFU)，與限制性內切酶你711和feoRI雙酶切質粒pPink-HC所得載體以T4連接酶16°C 連接過夜，轉化，涂板，得到質粒pPinkFLD-HC; 酶切質粒/^-pMD?18-T反應體系為：質粒i%-pMD?18-T0. 56yg/y1 10微升， 你/IIl微升，feaI(+^boRI)l微升，10XTbuffer3微升，0?l%BSA0?3微升，雙蒸水 14. 7微升； 酶切質粒pPink-HC反應體系為：質粒pPink-HC0. 73yg/y1 10微升，MI1. 5微 升，feoRI1. 5微升，10XHbuffer3微升，雙蒸水14微升； 連接反應體系為：片段PFU)1微升，載體1微升，10XT4buffer1微升，T4連接酶1微 升，雙蒸水6微升；其中，片段PFU)和載體的連接摩爾濃度比為1:3。
[0011] 進一步，優選的是步驟（3)的具體操作如下： 步驟（2)得到的質粒pPinkFLD-HC用限制性內切酶I和fcaI(+feoRI) 雙酶切消化后所得核苷酸片段與用限制性內切酶I和I雙酶切的質粒 pPinkA0Xl-HPV16Ll所得載體，以T4連接酶16 °C連接過夜，轉化，涂板，得到質粒 pPinkFLD-HPV16Ll； 酶切質粒pPinkFLD-HC:質粒pPinkFLD-HC0? 65yg/y1 10 微升，I1 微升，也31(+及^1)1微升，10\冊8131^€6143微升，100\85六0.3微升，雙蒸水14.7微升 ； 酶切質粒pPinkA0Xl-HPV16Ll:質粒pPinkA0Xl-HPV16Ll0? 65yg/y1 15 微升， I1微升，feoRI1微升，10XTbuffer3微升，0? 1%BSA0? 3微升，雙蒸水9. 7微升； 連接反應體系為：核苷酸片段1微升，載體2微升，10XT4buffer1微升，T4連接酶1 微升，雙蒸水5微升；其中，核苷酸片段和載體的連接摩爾濃度比為1:3。
[0012] 進一步，優選的是步驟（4)的質粒pPinkFLD-HPV16Ll酶切反應體系為：質粒 pPinkFLD-HPV16Ll0.373yg/yl15 微升，1.2 微升，lOXMbuffer3 微升，雙蒸水 10. 8微升。
[0013] 本發明還體佛那個一種在畢赤酵母中使用甲醛脫氫酶啟動子指導HPV16L1表達 的方法，該方法是使用上述得到的質粒pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子進行表達，具體步驟 如下： 步驟（1 )，將質粒pPinkFLD-HPV16Ll表達克隆子接種甘油復合物緩沖液培養基培養過 夜至菌液600納米波長處吸光值為2~6之間，然后使用甲醇復合物緩沖液培養基進行誘導 表達，將有表達的菌落保存作為種子甘油菌； 步驟（2)，將步驟（1)得到的種子甘油菌接種至酵母浸出粉胨葡萄糖培養基中培養，所 得一級種子液再接種至甘油復合物緩沖液培養基獲得二級種子液，將二級種子液分為等量 8份后使用8種不同誘導培養基培養，其中8種誘導培養基分別為葡萄糖-硫酸銨混合培 養基、葡萄糖-甲胺混合培養基、甘油-硫酸銨混合培養基、甘油-甲胺混合培養基、山梨 醇-硫酸銨混合培養基、山梨醇-甲胺混合培養基、甲醇-硫酸銨混合培養基和甲醇-甲胺 混合培養基； 步驟（3)，取步驟（2)中8種不同培養基誘導后24小時、48小時和72小時的酵母