樹干畢赤酵母基因表達系統及其構建與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，尤其是涉及一種樹干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis)的表達系統及其構建方法及應用。
【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學理論研宄的不斷深入和分子生物學手段的不斷創新，基因工程技 術得以迅速發展，取得了令人矚目的成績。作為基因工程技術的重要內容，基因表達技術滲 透到了工業、農業以及生命科學的各個領域，受到人們的廣泛重視。根據外源基因表達宿主 的不同，目前，已發展的基因表達系統有大腸桿菌表達系統、哺乳動物表達系統、酵母表達 系統等。其中酵母表達系統具有操作簡單、易于培養、生長速度快、成本低等優點，還具有 大腸桿菌表達系統所不具備的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點，因此得到越來越廣泛的應 用。
[0003] 釀酒酵母是研宄最多的酵母表達系統，然而釀酒酵母在表達外源基因方面還存在 一些缺點，如缺少易于調控外源蛋白表達的強啟動子，缺少恰當的外源蛋白轉錄后修飾系 統，外源蛋白分泌效率不理想等。因此需要尋找可替代的酵母表達系統來克服現有表達系 統的缺陷，從而進一步擴大酵母表達系統在基因工程中的應用范圍，更有效的促進蛋白的 工業化生產。
[0004] 樹干畢赤酵母（Scheffersomycesstipitis)因具有降解木聚糖，生成并發酵木糖 生產酒精、乳酸等工業產品的能力而成為研宄的熱點，被認為是極具有工業應用前景的半 子囊菌類酵母。木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素重要組成部分，而秸桿半纖維素 中木聚糖含量更是占到90%以上。隨著全球資源的不斷消耗，開發利用木聚糖等豐富的可 再生資源并生產人類期望的產品成為人們共同關注的焦點。
[0005] 自20世紀80年代起，人們逐漸認識到樹干畢赤酵母代謝木糖生產工業產品的潛 在優勢，開始對其木糖發酵的傳統發酵工藝進行優化。同時，隨著基因改良手段的興起， 尤其在樹干畢赤酵母全基因組測序工作（JEFFRIESTW，GRIGORIEVIV，GRIMW00DJ，et al.Genomesequenceofthelignocellulose-bioconvertingandxylose-fermenting yeastPichiastipitis[J].Naturebiotechnology，2007, 25 (3): 319-326)完成后，人們 逐漸將研宄方向轉向分子領域。
[0006] 樹干畢赤酵母自身的一些特點使其作為基因工程表達宿主具有很大的應用 潛力，如：⑴不具有酵解抑制有氧氧化效應（Crabtree-negative)(PRIORB，KILIAN S，PREEZJC.FermentationofD-xylosebytheyeastsCandidashehataeand Pichiastipitis[J] ?Processbiochemistry，1989, 24 (1) : 21-32)，在嚴格好氣條件 下能夠有效轉化碳源用于細胞生長，并且不會產生乙醇（GRGENSJF，PASS0THV，ZYL WH，etal.Aminoacidsupplementation,controlledoxygenlimitationand sequentialdoubleinductionimprovesheterologousxylanaseproductionby Pichiastipitis[J].FEMSYeastRes，2005, 5(6-7) :677-683)，有利于后期外源蛋白的高 效生產；（2)酵母為單倍體，較易分離特定突變株（HONWY，PETROSD，DENGX.Genetic transformationofxylose-fermentingyeastPichiastipitis[J].ApplBiochem Biotechnol，1991，28 (1) : 369-375)，在篩選營養缺陷型宿主菌株并構建有效轉化系統方面 具有較好優勢；（3)具有降解廉價木聚糖并利用生成的木糖進行發酵生產的能力。然而，研 宄發現，樹干畢赤酵母在基因表達過程中使用特殊的基因編碼系統，密碼子CUG編碼的亮 氨酸被替換為絲氨酸（LAPLAZAJM,TORRESBR,JINYS,etal.ShbleandCreadapted forfunctionalgenomicsandmetabolicengineeringofPichiastipitis[J].Enzyme andmicrobialtechnology, 2006, 38(6) :741_747)。同時由于對其研宄與應用開展的較 晚，樹干畢赤酵母作為外源基因表達系統的發展比較緩慢，遠不及釀酒酵母和巴斯德畢赤 酵母。
[0007] 目前，對構建樹干畢赤酵母表達系統的研宄僅停留在探索階段。現在發展的可利 用載體元件，如啟動子、篩選標記等還很少，無法滿足高效表達載體的構建與應用。因此，有 必要尋找高效的新型載體元件來構建適用于樹干畢赤酵母自身的基因表達系統，在此基礎 上，可采用該基因表達系統對樹干畢赤酵母進行基因工程改造，為構建新型酵母基因工程 菌奠定基礎，同時基因表達技術的應用以及有效基因表達系統的構建使樹干畢赤酵母利用 木糖轉化生產人類有用產品，建立可再生資源循環利用的生物加工工藝成為可能。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種樹干畢赤酵母基因表達系統 及其構建與應用。本發明的表達載體可實現在樹干畢赤酵母中的整合型或游離型表達，對 樹干畢赤酵母的基礎理論研宄及產品開發具有重要的意義。
[0009] 本發明的技術方案如下：
[0010] 本發明一方面涉及一種新型整合型表達載體，其為環狀，且可操作性地連接有以 下元件：
[0011] pMD19-Tsimple質粒骨架、rDNA同源整合序列、外源基因表達盒和篩選標記基因 表達盒；所述外源基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子，外源基因插入酶切位點以及 轉錄終止子；所述篩選標記基因包括啟動子、抗生素抗性基因、轉錄終止子。
[0012] 優選的，所述的rDNA同源重組序列為18srDNA，序列如SEQIDNO: 1所示。另一個 選擇是，所述的rDNA序列與SEQIDN0:1的相似性不低于90%，優選為95%，更優為98%。
[0013] 本發明還提供一種新型游離型表達載體，其為環狀，且可操作性地連接有以下元 件：
[0014]pMD19-Tsimple質粒骨架、樹干畢赤酵母來源的自主復制序列（PsARS2)、外源基 因表達盒和篩選標記基因表達盒；所述外源基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子，夕卜 源基因插入酶切位點以及轉錄終止子；所述篩選標記基因包括啟動子、抗生素抗性基因、轉 錄終止子。
[0015] 所述的表達載體中的外源基因表達盒啟動子包括SpADHP、SpXYLP;轉錄終止子包 括SpCYClT、SpXYLT。
[0016] 所述的表達載體中的外源基因表達盒啟動子和轉錄終止子的DNA序列來自一株 能夠利用木糖的酵母Spathasporapassalidarum，該酵母全基因組序列在NCBI(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的編號為NZ_AEIKOOOOOOOO,其中所述酵母可為來自美國農業 研宄菌種保藏中心的細胞株NRRLY-27907。
[0017] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和篩選標記基因，所述外源基因插 入所述外源基因表達盒中啟動子和轉錄終止子之間。在本發明的一個實施例中，所述外源 基因為8€口基因，該基因的〇嫩序列如5￡〇10勵：12所示。
[0018] 所述的SpADHP啟動子為Spathasporapassalidarum來源的乙醇脫氫酶基因ADH1 啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQIDN0:2所示。
[0019] 所述的SpXYLP啟動子為Spathasporapassalidarum來源的木糖還原酶基因XYL 啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQIDNO:3所示；
[0020] 所述的SpTEFlP啟動子為Spathasporapassalidarum來源的轉錄起始因子基因 TEF1啟動子，該啟動子的DNA序列如SEQIDN0:4所示；
[0021] 所述的SpCYClT終止子為Spathasporapassalidarum來源的細胞色素C基因CYC1 終止子，該終止子的DNA序列如SEQIDNO: 5所示；
[0022] 所述的SpXYLT終止子為Spathasporapassalidarum來源的木糖還原酶基因XYL 終止子，該終止子的DNA序列如SEQIDNO:6所示；
[0023] 所述的篩選標記基因表達盒中的啟動子為SpTEFlP;抗生素抗性基因可以是表達 載體中常用的；轉錄終止子為ScCYC1t。
[0024] 所述的ScCYClj#止子為Saccharomycescerevisiae來源的細胞色素C基因CYC1 終止子，該終止子的DNA序列如SEQIDNO: 7所示。
[0025] 所述的篩選標記基因表達盒中可包括一個以上的標記基因，所述標記基因可為潮 霉素B抗性基因、博來霉素抗性基因和/或G418;在本發明的一個實施方案中，所述標記基 因是潮霉素B抗性基因。
[0026] 所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQIDNO:8所示。
[0027] 所述的博來霉素抗性基因的DNA序列如SEQIDNO:9所示。
[0028] 所述的G418的DNA序列如SEQIDNO: 10所示。
[0029] 所述的自主復制序列（PsARS2)的DNA序列如SEQIDNO: 11所示。
[0030] 本發明所使用的酵母為樹干畢赤酵母。具體的，該酵母購自美國農業研宄菌種保 藏中心，保藏編號為NRRLY-7124。
[0031] 本發明提供了含有樹干畢赤酵母的整合型基因表達系統；且其中還含有基因表達 載體，所述基因表達載體從5'-3'依次包括以下可操作性連接的元件印1?19-18；[11^16質粒 骨架、rDNA同源重組序列、外源基因表達盒和抗生素篩選標記基因表達盒；所述外源基因 表達盒自上游至下游依次包括啟動子，外源基因插入酶切位點以及轉錄終止子；所述抗生 素篩選標記基因包括啟動子、抗生素抗性基因、轉錄終止子。所述含有樹干畢赤酵母的整合 型表達系統與上述環狀的新型整合型表達載體的各元件的序列相同。
[0032] 本發明還提供了含有樹干畢赤酵母的游離型基因表達系統；且其中還含有基因表 達載體，所述基因表達載體從5'-3'依次包括以下可操作性連接的元件印1?19-18；[11^16質 粒骨架、自主復制序列PsARS2、外源基因表達盒和抗生素篩選標記基因表達盒；所述外源 基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子，外源基因插入酶切位點以及轉錄終止子；所述 抗生素篩選標記基因包括啟動子、抗生素抗性基因、轉錄終止子。所述含有樹干畢赤酵母的 游離型表達系統與上述環狀的新型游離型表達載體的各元件的序列相同。
[0033] 具體而言，發明人按照下述技術方案制備得到了新型整合型表達載體：
[0034] 以Spathasporapassalidarum基因組DNA為模板，以引物P1和P2進行PCR擴 增獲得18srDNA同源重組序列；以引物P23和P24進行PCR擴增獲得SpTEFlP啟動子；以 引物P25和P26進行PCR擴增獲得SpADHlP啟動子；以引物P27和P28進行PCR擴增獲得 SpXYLP啟動子；以引物P29和P30進行PCR擴增獲得SpCYCl^止子；以引物P31和P32進 行PCR擴增獲得SpXYLT終止子。以PMD-hphm質粒DNA為模板，以引物P21和P22進行PCR 擴增獲得片段hphm-ScCYClT。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQIDNO. 14-15所示，所 述P21-P32的核苷酸序列如SEQIDNO. 34-45所示。
[0035] 以pMD19-Tsimple為骨架，將上述各片段連接，所述連接是在適當的限制酶酶切 位點上進行的。具體連接方式為：在pMD19-Tsimple的EcoRV酶切位點連接18srDNA后，沿 著18srDNA的方向依次連接外源基因表達盒啟動子、外源基因表達盒轉錄終止子、SpTEFlP 啟動子、hph^-ScCYClT。
[0036] 另外，發明人按照下述技術方案制備得到了新型游離型表達載體：
[0037] 以樹干畢赤酵母基因組DNA為模板，以引物P33和P34進行PCR擴增獲得自主復制 序列；以引物P23和P24進行PCR擴增獲得SpTEFlP啟動子；以引物P25和P26進行PCR擴 增獲得SpADHlP啟動子；以引物P27和P28進行PCR擴增獲得SpXYLP啟動子；以引物P29和 P30進行PCR擴增獲得SpCYClj#止子；以引物P31和P32進行PCR擴增獲得SpXYLT終止