一種高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生產β-丙氨酸中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高L-天冬氨酸a羧化酶活性的工程菌及其在生產0 -丙氨酸中 的應用。
【背景技術】
[0002] 0 -丙氨酸（0-alanine),即3-氨基丙酸（3-aminopropanoic)，是自然界中唯一 存在的0型非蛋白氨基酸，丙氨酸是一種重要的生化原料，可以用于合成泛酸、肌肽、 帕米膦酸鈉、巴柳氮等，在醫藥、飼料和食品領域有著十分廣泛的應用。
[0003]目前0_丙氨酸的合成方法主要有化學法和生物法。
[0004] 化學法合成0丙氨酸主要有丙烯腈法、丙烯酸法及琥珀酰亞胺降解法。丙烯腈 法使用丙烯腈和氨水氨化反應生成3 -氨基丙腈，再在酸性或堿性條件下水解即得，該方 法原料易得、成本較低，但有副反應，且水解過程中生成大量無機鹽，產物較難純化。丙烯 酸法使用丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸鹽與氨水氨化反應，在較高的溫度和壓力條件下得到 丙氨酸，合成工藝簡單、收率高，但卻需要高溫高壓。琥珀酰亞胺法是指將琥珀酰亞胺在 堿性氯酸鈉溶液中發生降解得到0 -丙氨酸，該法的工藝條件要求苛刻，原料成本較高且 易發生其它副反應，不適合工業化。總之，化學合成法的原料、中間體有毒，同時反應條件比 較苛刻，要求高溫高壓，對環境污染嚴重。
[0005] 生物法合成P-丙氨酸，國內相關報道的主要有兩種，一種是使用藤黃八疊球菌 將丙烯酸轉化為0-丙氨酸(轉化率為54%)，另一種是使用大腸桿菌BL21 (DE3)作為宿主， 表達來源于大腸桿菌的L-天冬氨酸a羧化酶，最終產丙氨酸2. 94g/L，遠遠達不到工 業化的水平。
【發明內容】
[0006] 本發明通過篩選不同來源的L-天冬氨酸a羧化酶，構建了基因工程菌，通過酶活 比較，提供了一種高L-天冬氨酸a羧化酶活性的工程菌及其在生產丙氨酸中的應用。
[0007] 本發明提供的工程菌，其構建方法依次包括如下步驟：（1)將目的蛋白的編碼基 因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，得到的重組質粒pET30-panDB ;所述目的蛋白如序 列表的序列6所示；（2)將步驟（1)得到的重組質粒pET30-panDB導入大腸桿菌BL21 (DE3)， 得到所述工程菌。
[0008] 所述目的蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所 /_J、i〇
[0009] 所述重組質粒pET30-panDB具體可為在載體PET30的NdeI和KpnI酶切位點之 間插入所述目的蛋白的編碼基因得到的重組質粒。
[0010] 本發明還保護所述工程菌在生產丙氨酸中的應用。所述應用具體可為以L-天 冬氨酸為底物生產丙氨酸。
[0011] 本發明還保護一種重組質粒，是將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的 多克隆位點，得到的重組質粒pET30-panDB ;所述目的蛋白如序列表的序列6所示。所述目 的蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。本發明還保護 所述重組質粒在生產0-丙氨酸中的應用。
[0012] 本發明還保護一種生產丙氨酸的方法，包括如下步驟：以L-天冬氨酸為底物， 采用所述工程菌進行生物轉化，得到丙氨酸。所述生物轉化的條件可為37°C、450rpm。 所述生物轉化的時間具體可為1-15小時。所述的方法中，所述工程菌通過如下方法擴大 培養：①挑取工程菌的單菌落，接種于l〇mL含50yg/ml卡那霉素的LB液體培養基，37°C、 200rpm振蕩培養12小時；②取步驟①得到的整個培養體系，接種于100mL含50iig/ml卡 那霉素的LB液體培養基，30°C、200rpm振蕩培養12h，離心收集菌體。
[0013] 本發明中通過篩選不同來源的L-天冬氨酸a羧化酶，提供了一株高產丙氨 酸基因工程菌，該菌株可以穩定的高表達L-天冬氨酸a羧化酶，將L-天冬氨酸轉化成 3 -丙氨酸，酶活達2. 09U/mL，轉化15h后0 -丙氨酸的產量為178g/L，轉化率達99%。
[0014] 采用本發明提供的方法制備P_丙氨酸，無需添加誘導劑，整個過程無需高溫、高 壓，同時具有條件溫和、操作簡單、對環境友好等優點，已達工業化應用水平。
【附圖說明】
[0015] 圖1為標準品溶液的HPLC圖譜。
[0016] 圖2為工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁進行步驟3得到的上清液的酶 活。
[0017] 圖3為生物轉化過程中轉化體系中生成的0-丙氨酸濃度。
【具體實施方式】
[0018] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0019]載體pET_30a(+):Novagen公司。大腸桿菌BL21 (DE3) :Novagen公司。L-天冬氨 酸標準品：生工生物工程(上海）股份有限公司，產品編號AB0091CAS (56-84-8)。0 -丙氨 酸標準品：生工生物工程(上海）股份有限公司，產品編號A6168CAS (107-95-9)。
[0020] 實施例1、重組質粒和工程菌的構建
[0021] 序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子即大腸桿菌BL21(DE3)中L-天冬氨 酸a-羧化酶的編碼基因。序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子即谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacteriumglutamicum)中L-天冬氨酸a-羧化酶的編碼基因。序列表的序列 3所不的雙鏈DNA分子即結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)中L-天冬氨酸 a-羧化酶的編碼基因。序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子即枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)中L-天冬氨酸a-羧化酶的編碼基因。
[0022] 一、工程菌甲的構建
[0023] 1、重組質粒pET30_panDE的構建
[0024] (1)合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。
[0025] (2)以步驟（1)合成的雙鏈DNA分子為模板，用Ec-pand-for和Ec-pand-rev組成 的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0026] Ec-pand-for：5, -GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3'；
[0027] Ec-pand-rev：5, -TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3'。
[0028] (3)用限制性內切酶NdeI和KpnI雙酶切步驟（2)的PCR擴增產物，回收酶切產 物。
[0029] (4)用限制性內切酶NdeI和KpnI雙酶切載體pET_30a(+)，回收約5300bp的載 體骨架。
[0030] (5)將步驟（3)的酶切產物和步驟（4)的載體骨架連接，得到重組質粒 pET30-panDE。根據測序結果對重組質粒pET30-panDE進行結構描述如下：在載體 pET-30a(+)的NdeI和KpnI酶切位點之間插入了序列表的序列1自5'末端第4至381 所示的雙鏈DNA分子。
[0031] 2、工程菌甲的構建
[0032]將重組質粒pET30-panDE導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到的重組菌即為工程菌甲， 又稱工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET30-panDE。
[0033] 二、工程菌乙的構建
[0034] 1、重組質粒pET30_panDG的構建
[0035] (1)合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0036](2)以步驟（1)合成的雙鏈DNA分子為模板，用cg-pand-for和cg-pand-rev組成 的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0037]cg-pand-for：5, -GGCTTCCATATGCTGCGTACCATCCTG-3'；
[0038] cg-pand-rev：5, -TTACGGCTCGAGTCAAATACTACGGCTCGTCAGC-3'。
[0039] (3)用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切步驟（2)的PCR擴增產物，回收酶切產 物。
[0040] (4)用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切載體pET_30a(+)，回收約5300bp的載 體骨架。
[0041] (5)將步驟（3)的酶切產物和步驟（4)的載體骨架連接，得到重組質粒 pET30-panD。。根據測序結果對重組質粒pET30-panDC進行結構描述如下：在載體 pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5'末端第4至411 所示的雙鏈DNA分子。
[0042] 2、工程菌乙的構建
[0043]將重組質粒pET30-panDC導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到的重組菌即為工程菌乙， 又稱工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET30-panDc。
[0044] 三、工程菌丙的構建
[0045] 1、重組質粒pET30_panDM的構建
[0046] (1)合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。
[0047] (2)以步驟（1)合成的雙鏈DNA分子為模板，用mt-pand-for和mt-pand-rev組成 的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0048]mt-pand-for：5, -GGCTTCCATATGTTACGGACGATGCTG-3'；
[0049] mt-pand-rev：5,-TTACGGGGTACCCTATCCCACACCGAGCCG-3'。
[0050] (3)用限制性內切酶NdeI和KpnI雙酶切步驟（2)的PCR擴增產物，回收酶切產 物。
[0051](4)用限制性內切酶NdeI和Kpn I雙酶切載體pET-30a(+)，回收約5300bp的載 體骨架。
[0052] (5)將步驟（3)的酶