甲型副傷寒沙門菌ompN基因原核表達系統及其重組表達蛋白的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及甲型副傷寒沙門菌ompN基因原核表達系統 及其重組表達蛋白的應用。
【背景技術】
[0002] 傷寒和副傷寒是由沙門菌屬傷寒桿菌（Salmonella typhi)、甲型副傷寒沙門菌 (Salmonella paratyphi A)、肖氏沙門菌（Salmonella schottmueller)感染，偶由希氏沙 門菌（Salmonella hirschfeldii)感染引起的常見人類急性傳染病。每年全球傷寒或副傷 寒病例數高達2000萬左右，死亡病例超過20萬以上。傷寒或副傷寒也是我國常見的法定 乙類傳染病之一，每年發病率均位于所有乙類傳染病前5位，故是我國重點監控并進行計 劃免疫的傳染病之一。
[0003] 接種疫苗是預防和控制傳染病的根本措施，對于控制無癥狀及恢復期帶菌者較 多、耐藥率較高的傷寒或副傷寒，接種疫苗尤為必要。早年用于預防接種的傷寒、甲型副傷 寒和乙型副傷寒三聯全菌死疫苗，因其免疫保護率低(約50%)、有效免疫力維持時間較短， 尤其是副作用很大，僅中、強不良反應即高達8. 6%，我國早已停止使用該疫苗進行預防接 種。傷寒桿菌具有化學成分為聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸的莢膜多糖，因其與細菌毒 力密切相關且有較強抗原性，故稱之為毒力抗原（virulentantigen,Vi-Ag)。上世紀90年 代中期，以傷寒桿菌莢膜多糖作為抗原的疫苗在中國、法國、墨西哥研制成功并上市，稱之 為Vi疫苗。Vi疫苗安全、不良反應小、保護效果好(約75%)且抗體維持時間長，現已代替 三聯全菌死疫苗用于免疫接種。細菌學上早已明確，傷寒桿菌、肖氏沙門菌和希氏沙門菌有 Vi抗原，但甲型副傷寒沙門菌無Vi抗原。因此，Vi疫苗不僅不能防控甲型副傷寒沙門菌感 染，其免疫篩選作用有可能導致甲型副傷寒沙門菌流行。研究并明確甲型副傷寒沙門菌表 面保護性抗原，研發具有預防甲型副傷寒沙門菌感染的疫苗具有重要的醫學意義。
[0004] 革蘭陰性菌具有外膜及外膜蛋白（outermembraneproteins,0MP)，外膜蛋白是 革蘭陰性菌重要的表面抗原成分，沙門菌也不例外。然而，傳統生化方法提取細菌蛋白抗原 普遍存在產量及得率低、不同批次差異大等問題，難以用于疫苗生產，采用基因工程技術表 達外膜蛋白抗原分子、制備基于重組外膜蛋白抗原的基因工程疫苗可能是研發甲型副傷寒 沙門菌疫苗的唯一有效途徑。
[0005] 2004年McClelland等報道了甲型副傷寒沙門菌全基因序列，其中至少有21個 0MP編碼基因（GenBank accession No. : CP000026)。我們以往研究證實，甲型副傷寒沙門 菌SpaO、OmpA和NmpC有免疫保護作用，但其余0MP免疫原性和免疫保護作用未有研究報 道。病毒僅有一種或數種表面蛋白抗原，故采用單一的病毒主要表面蛋白抗原制備的基因 工程疫苗即可獲得良好的免疫保護效果。細菌是原核細胞型微生物，表面抗原復雜多樣，采 用單一蛋白抗原往往不易獲得令人滿意的免疫保效果，這可能是采用單一重組蛋白抗原基 因工程疫苗免疫效果不佳的主要原因，采用多種蛋白抗原制備的多價基因工程疫苗有可能 獲得較為理想的免疫保護效果。因此，除SpaO、OmpA和NmpC外，研究其他甲型副傷寒沙門 菌0MP免疫原性和免疫保護效果，以便從中篩選出若干種分布廣泛、序列保守、抗原性和免 疫保護作用較強的0MP抗原，可為研制多價甲型副傷寒沙門菌基因工程疫苗奠定基礎。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供甲型副傷寒沙門菌ompN 基因原核表達系統及其重組表達蛋白的應用的技術方案。
[0007] 所述的甲型副傷寒沙門菌因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
[0008] 所述的甲型副傷寒沙門菌〇呢《因的重組表達蛋白，其特征在于該表達蛋白的 氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0009] 所述的甲型副傷寒沙門菌ompN基因的重組表達蛋白在對甲型副傷寒桿菌的免疫 保護中的應用。
[0010] 所述的甲型副傷寒沙門菌ompN基因的重組表達蛋白在制備治療甲型副傷寒疫苗 中的應用。
[0011] 所述的含有權利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達載體。 [0012] 所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達載體的構建方法，其特征在于包 括以下步驟： 1) 〇?/?7\基因擴增，得到基因； 2) 采用T-A克隆試劑盒將堪因克隆入pMD-19-T中形成重組質粒pMD-19-T 3) 將pMD-19-T_#與原核表達載體pET42a用NdeI和XbaI雙酶切，回收目的DNA條 帶，將300?500ng的提純的DNA條帶與100ng線性化pET42a混合，在T4DNA連接酶作 用下形成重組表達載體pET42aMP#。
[0013] 所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達載體的構建方法，其特征在于所 述的步驟1)中以甲型副傷寒沙門菌基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的下游引物進行PCR擴增。
[0014] 所述的含有權利要求1所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達工程菌。
[0015] 所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達工程菌構建方法，其特征在于包 括以下步驟： 1) 〇?/?7\基因擴增，得到基因； 2) 采用T-A克隆試劑盒將堪因克隆入pMD-19-T中形成重組質粒pMD-19-T 3) 將pMD-19-T_#與原核表達載體pET42a用NdeI和XbaI雙酶切，回收目的DNA條 帶，將300?500ng的提純的DNA條帶與100ng線性化pET42a混合，在T4DNA連接酶作 用下形成重組表達載體pET42aMP#; 4) 采用CaCl2法將pET42a 轉化入表達宿主菌萬.co/iBL21DE3形成工程菌株五 BL21DE3-。
[0016] 所述的甲型副傷寒沙門菌因的重組表達工程菌構建方法，其特征在于所 述的步驟1)中以甲型副傷寒沙門菌基因組DNA為模板，采用核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的下游引物進行PCR擴增。
[0017] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 1.甲型副傷寒沙門菌臨床菌株ompN基因PCR擴增及純化產物測序結果表明，該基因分 布于所有臨床菌株，其編碼的外膜蛋白序列保守，可以作為細菌基因工程疫苗的候選抗原。
[0018] 2.膜定位顯示OmpN定位于甲型副傷寒沙門菌表面。OmpN表達于細菌表面是可以 作為細菌基因工程疫苗的候選抗原的必要條件。
[0019] 3.利用大腸桿菌為表達宿主菌，其結構簡單、生長速度快的特點，易于培養和發 酵、培養工程工程提取重組表達外膜蛋白rOmpN產量高、有效降低了生產成本，且表達條件 習易于標準化適用于規模化生產。
[0020] 4.動物實驗結果提示重組膜蛋白rOmpN具有良好的免疫原性，后期保護試驗證實 該蛋白質具有良好的免疫保護能力。
【附圖說明】
[0021] 圖1為甲型副傷寒沙門菌ompN基因PCR檢測結果； 圖中：泳道M:DNAmarker;泳道1 :空白對照；泳道2?6 :分別為甲型副傷寒沙門菌 50001參考標準株和4株甲型副傷寒沙門菌臨床代表株ompN基因擴增條帶。
[0022] 圖2為甲型副傷寒沙門菌rOmpN表達及提取效果； 圖中：泳道M:蛋白marker;泳道1 :野生型pET42a空白對照；泳道2和3 :分別為表達 和提純的rOmpN。
[0023] 圖3為甲型副傷寒沙門菌OmpN膜結構分析結果。
[0024] 圖4為甲型副傷寒沙門菌OmpN膜定位（X1500); 圖中：A:r0mpN兔抗血清為一抗時OmpN膜定位；B:正常兔血清為一抗的陰性對照。
【具體實施方式】
[0025] 以下結合實施例來進一步說明本發明。
[0026] 1材料和方法 1. 1菌株和血清標本來源 甲型副傷寒沙門囷參考標準株50001購自北點中國藥品生物制品檢定研究院。126株 甲型副傷寒沙門菌臨床菌株、56份甲副傷寒病人恢復期血清分別由浙江省寧波市、溫嶺市 和杭州市疾病預防控制中心提供，15份微量肥達試驗結果陰性的健康體檢者血清由浙江省 新華醫院提供。
[0027] 1. 基因擴增及測序 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（Axygen)提取上述甲型副傷寒沙門菌基因組DNA，紫 外分光光度法測定其濃度[13]。根據GenBank中甲型副傷寒沙門菌ATCC9150株基因 序列（accessionNo. :CP000026)及其限制性核酸內切酶位點分析結果，設計PCR引物并由 上海Invitrogen公司合成。上游引物(其核苷酸序列如SEQIDNO:3):CGCCATATG(Nde I)atgaaaagaaaagtattggca-3'，下游引物(其核苷酸序列如SEQIDNO:4):CGCCTC GAG(XhoI)gaactggtaaaccatacccag-3'。以 100ng甲型副傷寒沙門菌DNA為模 板，采用PCR擴增全長基因片段，反應參數：94°C5min;94°C30s、52°C30s、72°C60 s，30個循環；72°C10min。擴增產物經溴乙錠預染色的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳法檢查后，采 用T-A克隆試劑盒（TaKaRa)將其克隆入pMD-19-T中形成重組