豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒基因工程技術領域，具體地，涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合 病毒RvHBJX及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS) 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病，主要以懷孕母豬發生 流產、早產、產死胎和木乃伊胎等繁殖障礙疾病以及仔豬和生長育肥豬出現呼吸道癥狀為 特征（Rossowetal.，1994)。2006年初夏以來，嚴重型PRRS暴發，并迅速席卷我國主要養 豬地區，造成大批生豬死亡，給我國養豬業造成巨大經濟損失。疫苗被認為是防控與凈化 PRRSV的重要工具。但是，PRRSV感染能引起免疫抑制與持續性感染，減毒活疫苗的長期使 用存在毒力返強等潛在風險（Madsenetal.，1998)。感染性克隆技術為新型疫苗的研宄提 供了技術保障。自從第一株PRRSV的感染性克隆成功構建以來（Meulenbergetal.，1998)， 反向遺傳操作技術已用于分析和研宄PRRSV的基因結構與功能、病毒RNA合成的調控機制、 致病機制，以及新型疫苗的研宄。
[0003] 一般說來，用同源性高的毒株進行免疫能獲得較好的抵抗力。因此將流行毒株的 某些基因置換到傳統疫苗中，也許能提高疫苗的免疫效力。Ellingson等人利用MLV疫苗 毒、MN184毒株為親本病毒構建了 5個嵌合病毒，其中兩個是MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/ 0RF1相互置換的病毒，一個是以MLV為骨架置換了MN1840RF5-6的嵌合病毒，一個是以MLV 為骨架置換了MN1840RF7-3 'UTR的嵌合病毒，一個是以MLV為骨架置換了MN184毒株3 'UTR 的嵌合病毒。這些嵌合病毒免疫后的攻毒實驗顯示MLV疫苗毒、MN184毒株5'UTR/0RF1相 互置換的病毒及以MLV為骨架置換了MN1840RF5-6的嵌合病毒能夠誘導產生與傳統細胞 培養疫苗相似的抵抗力。Lee等人用韓國PRRSV流行毒株的結構蛋白編碼區置換了感染性 cDNA克隆質粒中的相應區域并拯救出相應的PRRSV嵌合病毒，該病毒能夠被自然感染豬的 血清所中和，相應的體內試驗尚未開展。以上結果說明通過嵌合病毒來研制新型疫苗是可 行的。
[0004]我國先前的分離毒株PRRSVHB-1 (sh) /2002(GenBank收錄號AY150312)(Gao etal.，2004)，在全基因組序列上與高致病性毒株的同源性最高（97. 2%)，但致病性 低。該毒株經MARC-145細胞連續傳代，獲得能在MARC-145細胞中良好增殖的克隆毒株 HB-1/3. 9 (GenBank收錄號EU360130)(冉智光等，2006)，與高致病性毒株的全基因組序列 同源性為97. 4%。這兩個毒株基因組高度同源而生物學特性，如毒力、致病性、生長特性、免 疫原性等差異較大。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒；本發明的另一目的在 于提供該嵌合病毒作為嵌合疫苗候選株的用途。
[0006] 本發明首先提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒，命名為RvHBJX，是以低致 病性PRRSV毒株HB-1/3. 9為骨架，含有高致病性PRRSV毒株JXwn06結構蛋白編碼區的嵌 合病毒。
[0007] 其中，高致病性PRRSV毒株JXwn06結構蛋白編碼區的基因序列如SEQIDNO. 1所 不〇
[0008] 本發明提供了豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長cDNA克隆質粒，是通過 以下方法構建得到：
[0009] (1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴增得到JXwn06的整個結構蛋白編碼區，擴增產物 命名為HJSP-S2 ;
[0010] (2)以pWSK-HB-1/3. 9為模板，分別PCR擴增HB-1/3. 9結構蛋白編碼區兩側序列， 分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0011] (3)將步驟（1)和（2)的擴增產物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S33個 片段作為模板，PCR擴增得到HJSP-S123 ;
[0012] (4)HJSP-S123純化后經RsrII、AscI雙酶切，連接到相同雙酶切的 pWSK-HB-1/3. 9質粒中，完成PRRSV嵌合質粒的構建，命名為pW-HJSP。
[0013] 其中，步驟（l)PCR擴增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQID NO. 2、3 所示；
[0014] 步驟（2)PCR擴增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引物，其核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 4-7所示；
[0015] 步驟（3)?〇?擴增的引物為耵-包81〇1^和耵-包8丨〇111?，其核苷酸序列如5￡0 10 NO. 8-9 所示。
[0016] 本發明還提供了制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法，包括以 下步驟：
[0017] (1)構建豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒RvHBJX全長cDNA克隆質粒；
[0018] (2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。
[0019] 上述方法中，步驟（1)的克隆質粒通過以下方法構建得到：
[0020] 1)以pWSK-JXwn為模板，PCR擴增得到JXwn06的整個結構蛋白編碼區，擴增產物 命名為HJSP-S2 ;
[0021] 2)以pWSK-HB-1/3. 9為模板，分別PCR擴增HB-1/3. 9結構蛋白編碼區兩側序列， 分別命名為HJSP-S1、HJSP-S3 ;
[0022] 3)將步驟1)和2)的擴增產物純化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2,HJSP-S33個片 段作為模板，PCR擴增得到HJSP-S123 ;
[0023] 4)HJSP-S123純化后經RsrII、AscI雙酶切，連接到相同雙酶切的 pWSK-HB-1/3. 9質粒中，完成PRRSV嵌合質粒的構建，命名為pW-HJSP。
[0024] 全基因組序列測定表明，pW-HJSP質粒中結構蛋白編碼區與JXwn06 -致，而其余 骨架與HB-1/3. 9 -致，同時HB-1/3. 9親本拯救病毒的兩個遺傳標記MluI與SfiI酶切 位點仍然存在。
[0025] 進一步地，步驟1)中PCR擴增使用的引物為JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如 SEQIDNO. 2、3 所示；步驟 2)中PCR擴增分別以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R為引 物，其核苷酸序列分別如SEQIDNO. 4-7所示；步驟3)中PCR擴增的引物為HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQIDNO. 8-9所示。
[0026] 本發明的制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒嵌合病毒RvHBJX的方法中，步驟（2)的嵌 合病毒RvHBJX的拯救通過以下方法來實現：
[0027] 1)用RsrII、PacI內切酶消化pW-HJSP全長cDNA克隆質粒，使質粒線性化；獲 得的線性化質粒經酚氯仿抽提及無水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度計測定純化后質粒 的濃度；
[0028] 2)立即進行體外轉錄；
[0029] 3)轉錄產物經TURBODNaseI消化后，用DMRIE-C脂質體轉染MARC-145細胞，每 天觀察并記錄細胞病變CPE的產生情況；將出現明顯CPE的細胞培養上清在MARC-145細胞 上進行連續傳代，每代3-5d。獲得的拯救病毒即為RvHBJX。
[0030] 在本發明的實施例中，上述步驟2)的體外轉錄是按照mMessagemMachinc?High YieldCappedRNATranscriptionkit(AmbionInc.，Texas,USA)操作說明進行的。
[0031] 本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征嵌合疫苗，含有本發明提供的豬繁殖與呼 吸綜合征嵌合病毒RvHBJX或其傳代培養后的病毒。
[0032] 本發明提供了豬繁殖與呼吸綜合征嵌合病毒或其傳代培養后的病毒在制備疫苗 中的用途。
[0033] 本發明發現嵌合病毒RvHBJX在MARC-145細胞上連續傳代80次后，病毒滴度由第 5代的104 5TCID5(l/mL升高至107.51TCID5(l/mL。經過多次連續的體外傳代，嵌合病毒的細胞適 應能力顯著提高。
[0034] 本發明通過選擇RvHBJXP40、P60、P80毒株人工感染仔豬，分析比較其對高致病性 PRRSV感染的免疫保護性，結果發現PRRSV嵌合毒株RvHBJXP40、P60和P80細胞傳代毒株 免疫仔豬后均能減輕感染仔豬的臨床癥狀，降低感染仔豬血清中的病毒載量，顯著降低仔 豬的死亡數量，減輕病毒感染造成的肺臟損傷。該嵌合病毒經MARC-145細胞體外連續傳代 80次，該病毒遺傳性質表現穩定；病毒對宿主細胞的適應性隨傳代次數的增加逐漸增強； PRRSV嵌合毒株RvHBJXP60傳代60次（P60)及以上對本體動物具有較好的安全性，且接種 后能夠對高致病性PRRSV毒株感染提供100%的免疫保護，可作為豬繁殖與呼吸綜合征的 疫苗候選株開發。
[0035] 經動物安全性試驗及攻毒保護性試驗證明，本發明所獲得的豬繁殖與呼吸綜合征 嵌合疫苗HBJX接種仔豬后不會引起明顯的臨床癥狀，作為疫苗使用的安全性較好；并能夠 為感染仔豬提供較好的免疫保護，減輕高致病性PRRSV感染帶來的危害。該嵌合疫苗的病 毒骨架來源于臨床分離的自然低