高鹽度馴化提高微藻生長速率和細胞油脂含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明是關于生物質能利用技術，特別涉及高鹽度馴化提高微藻生長速率和細胞油脂含量的方法。
【背景技術】
[0002]利用海洋微藻吸收太陽能制取生物柴油等清潔可再生的液體燃料，對于解決石油等化石能源日益短缺和燃燒污染嚴重的危機和矛盾具有重要意義。微藻生長非常迅速，生理代謝功能強大，光合作用效率很高，利用海水資源并吸收大量CO2進行光合作用，通過綠色清潔的生物化學過程合成富集油脂(Sheehan et al., 1998 ；Huntley et al.，2007)，可轉化制取熱值高達41MJ/kg的高品位生物柴油，因此能夠替代石化柴油應用于交通工具，并且燃燒時不排放SO2等污染氣體。據美國研宄機構預測(Benemann et al.，2008)，每平方公里的能源微藻每年生產生物柴油的潛力是36000-150000桶/年，其產油潛力是大豆油(250桶/年)的144-600倍，是麻瘋樹油(1200桶/年)的30-125倍，是棕櫚油(3600桶/年)的15-41倍，故微藻是一種很有發展前景的生物柴油原料。
[0003]但微藻生長速率與油脂富集之間存在很大的相互矛盾，當絕大多數微藻達到最佳生長速率時，其細胞中油脂含量較低；而人為控制生長條件使微藻單位干重的油脂含量增加時，則使得微藻的生長速率和太陽能轉化效率明顯降低(Dempster et al.，1998)，所以開發生長速率快和油脂產量高的新藻種是關鍵所在。優勢藻株篩選方法主要有三個方面:
(I)天然藻種篩選:美國能源部已經確切證實硅藻屬的藻類油脂含量相對其他的藻種油脂含量較高(Sheehan et al.，1998 ;)，天然條件下藻類油脂含量10_30%;經過馴化其中一些微藻的光合生產率已經達到50g.m_2.cf1，含油率達到80%。(2)細胞工程！Zaslavskaia等人(Zaslavskaia et al.，2001)通過基因工程技術將編碼葡萄糖轉運體的基因引入一種無法進行異養生長的娃藻Phaeodactylum tricomutum細胞中，使其能在黑暗中利用外源葡萄糖進行異養生長并達到100g/L的細胞密度；(3)宏觀生長因素調控:美國可再生能源國家實驗室、加州大學伯克利分校等主要研宄機構(Sheehan et al.，1998 ；Hu et al.，2008)在實驗室條件下研宄開發了多種富含油脂的硅藻和綠藻，在培養基缺氮、缺硅的條件下最高油脂含量達到40-66%，是自然條件下微藻油脂含量的3-12倍。
[0004]目前國際上較多趨向于自然篩選和轉基因途徑(Jarvis et al.，2008)，對誘變途徑也有很大興趣但鮮見研宄報道。Ben-Amotz等人(Ben-Amotz et al., 1985)證實在高鹽度下有些藻種發現有很高的油脂含量，Cohen等人(Cohen et al.，1988)也發現生長在高鹽度下的Porphyridium Cruentum藻細胞含有更高比例的亞油酸和花生四稀酸，兩者與軟脂酸一起是構成貯存甘油三酯的主要脂肪酸，但是高鹽度馴化能否提高微藻生長速率目前尚很少文獻報道。故如何采用高鹽度梯度馴化方法選育出生長速率快和油脂含量高的藻種是一個技術難題，對于開發微藻新能源降低生產成本具有重要意義。
【發明內容】
[0005]本發明的主要目的在于克服現有技術中的不足，提供一種高鹽度馴化提高微藻生長速率和細胞油脂含量的方法。為解決上述技術問題，本發明的解決方案是:
[0006]提供高鹽度馴化提高微藻生長速率和細胞油脂含量的方法，具體包括下述步驟:
[0007](I)按接種量為5%?10%將微藻液體接種到IL的三角瓶，三角瓶中預先裝800mL的培養基；在恒溫20?25°C、每天依次光照12h和黑暗12h的條件下通入空氣放大培養10?15天，且光照時的光照強度為3500?40001ux ；
[0008](2)取擴大培養后的藻種以5?10%接種量接種到容量為400mL圓柱瓶中，圓柱瓶中的培養基為250?350mL，初始鹽度為0%，通入70?90mL/min的空氣，培養8?12天后以5?10%的接種量轉接入到鹽度為0.2?0.4%的培養基中培養8?12天；
[0009](3)取步驟⑵中培養后的藻液以5?10%的接種量轉接入到鹽度為0.5?0.7%的培養基中培養8?12天，按鹽度梯度為0.3%重復上述步驟直至將微藻接種至鹽度為2.9?3.1 %的培養基中；
[0010](4)將上述藻種在鹽度為2.9?3.1 %的培養基中連續培養3?5代，即獲得能快速生長的高油脂含量藻種。
[0011]本發明中，所述培養基的組分比例為:0.15g NaHC03、0.02g KH2P04、0.027g VB1,
1.5X10-6g VB12,0.2g Na2S13.9H20、1.0g NaN03、0.0005g B1tin、ImL 微量元素和 980mL
人工海水。
[0012]本發明中，所述微量元素的組分比例為:1000mL蒸餾水中含有4.35g Na2EDTA,7.3mg Na2MoO4.2H20、12mgCoCl2.6Η20、3.9g FeC6H5O7.5H20、1mg CuSO4.5H20、23mg ZnS04、178mg MnCl2.4H20 和 600mg H3B03。
[0013]本發明中，所述人工海水的組分比例(鹽度=3.0% )為:1000mL蒸餾水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na2S04、0.3577g KC1、9.3042g MgCl2.6Η20、1.3044g CaCl2、0.0862gKBr,0.0226g H3B03、0.2760g NaF 和 0.0219g SrCl2.6H20。
[0014]本發明中，所述步驟(2)?(4)的培養條件為:人工溫室20?30°C，初始pH值為8?10，每天依次光照12h和黑暗12h，且光照時的光照強度為6000?lOOOOlux。
[0015]本發明中，所述微藻液體是指:從自然環境中篩選得到的天然藻種、物理化學誘變得到的藻種突變體或經過基因改良得到的轉基因藻種。
[0016]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0017]采用高鹽度梯度馴化方法，微藻細胞的碳氮代謝途徑以及油脂合成途徑進行了重建，脯氨酸、ABC轉運蛋白、蛋白酶體、谷胱甘肽的代謝通路變化較大，乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)、β -酮脂酰-ACP合酶I和II等關鍵生物酶表達量上調，從而有效提高了微藻生長速率和細胞富集油脂的能力。高鹽度梯度馴化后微藻生長速率增加了 53.8%，細胞內油脂含量增加130.5%。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細描述:
[0020]如圖1所示的一種高鹽度馴化提高微藻生長速率和細胞油脂含量的方法，具體包括下述步驟:
[0021](I)按接種量為5%?10%將微藻液體接種到IL的三角瓶(800mL的培養基)，所述原始藻液包括從自然環境中篩選得到的天然藻種、物理化學誘變得到的藻種突變體、經過基因改良得到的轉基因藻種。在恒溫20?25°C、光照強度3500?40001ux、每天依次光照12h黑暗12h的條件下通入空氣擴大培養10?15天。
[0022](2)取擴大培養后的藻種以5?10%接種量接種到容量為400mL圓柱瓶中，圓柱瓶中的培養基為250?350mL，初始鹽度為O %，通入70?90mL/min的空氣，在溫度為20?30°C，光照強度6000?lOOOOlux，光暗比12h: 12h，初始pH值為8?10的條件下培養8?12天后，以5?10%的接種量轉接入至鹽度為0.2?0.4%的培養基中，繼續以同樣的條件培養8?12天。
[0023]所述培養基組成為:0.15g NaHC03、0.02g KH2P04、0.027g VB1U.5 X 1^6gVB12,0.2g Na2S13.9H20、1.0g NaN03、0.0005g B1tinUmL 微量元素和 980mL 鹽度為0.2?3.0 %人工海水或去離子水。其中，所述微量元素組成為:100mL蒸餾水中含有 4.35gNa2EDTA、7.3mg Na2MoO4.2H20、12mgCoCl2.6Η20、3.9g FeC6H5O7.5H20、1mgCuSO4.5H20、23mg ZnSO4 U 78mg MnCl2.4H20 和 600mg H3BO30 所述人工海水配方(鹽度=3.0 % )為:100mL 蒸餾水中含有 21.2157g NaCl,3.407g Na2S04、0.3577g KCl,9.3042g MgCl2.6Η20、1.3044g CaCl2、0.0862g KBr、0.0226g H3B03、0.2760g NaF和0.0219gSrCl2.6H20o
[0024](3)取步驟⑵中培養后的藻液以5?10%的接種量轉接入至鹽度為0.5?0.7%的培養基中，在溫度為20?30°C，光照強度6000?lOOOOlux，光暗比12h:12h，初始pH值為8?10的條件下培養8?12天。按鹽度增量0.3%重復上述步驟直至將微藻接種至鹽度為2.9?3.1 %的培養基中。
[0025](4)將上述藻種在鹽度為2.9?3.1%的培養基中，溫度為20?30°C，光照強度6000?lOOOOlux，光暗比12h:12h，初始pH值為8?10的條件下培養3?5代。即獲得能快速生長的高油脂含量藻種。
[0026]下面的實施例可以使本專業的專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0027]實施例1
[0028](I)按接種量為5%將菱形藻液體接種到IL的三角瓶(SOOmL的培養基)，在恒溫20°C、光照強度35001ux、在每天依次光照12h黑暗12h的條件下通入空氣放大培養10天。
[0029](2)取擴大培養后的藻種以5%接種量接種到容量為400mL圓柱瓶中，圓柱瓶中的培養基為250mL，初始鹽度為O %，通入70mL/min的空氣，在溫度為25°C，光照強度80001UX，光暗比12h:12h，初始pH值為9的條件下培養8天后